A klaszterezett, szabályosan egymás közé helyezett rövid palindromikus ismétlődések (CRISPR) egy harmadik generációs genomszerkesztési technika, amely nagy áteresztőképességű eredményeivel forradalmasította a világot. Különböző biológiai betegségek és fertőzések kezelésére használták. Különböző baktériumok és más prokarióták (például archeák) szintén rendelkeznek CRISPR/Cas9 rendszerekkel a fágok elleni védekezéshez. Jelentések szerint a CRISPR/Cas9 alapú stratégiák gátolhatják a tripla negatív emlőrák (TNBC) növekedését és progresszióját azáltal, hogy a potenciálisan megváltozott rezisztenciagéneket, transzkripciót és epigenetikai szabályozást célozzák meg. Ezek a terápiás beavatkozások segíthetnek olyan kihívást jelentő problémák kezelésében, mint a gyógyszerrezisztencia, amelyet még a TNBC-ben is megfigyelnek. Jelenleg különféle módszereket alkalmaznak a CRISPR/Cas9 célsejtekhez juttatására, például fizikai (mikroinjekció, elektroporáció és hidrodinamikai módok), virális (adeno-asszociált vírus és lentivírus) és nem virális (liposzómák és lipid nanorészecskék). Bár a TNBC molekuláris okainak tanulmányozására különféle modelleket fejlesztettek ki, a genomszerkesztő eszközök in vivo juttatására szolgáló érzékeny és célzott módszerek hiánya korlátozza klinikai alkalmazásukat. Összefoglalva, ez az áttekintés átfogóan vizsgálja a CRISPR/Cas9 kezelés előrehaladását, kihívásait, korlátait és kilátásait TNBC esetén a meglévő bizonyítékok alapján. Kiemeljük azt is, hogy a mesterséges intelligencia és a gépi tanulás kombinációja hogyan javíthatja a CRISPR/Cas9 stratégiákat a TNBC kezelésében.
A rákot a kontrollálatlan sejtosztódás, a sejtciklus ellenőrzőpontjainak megzavarása és a tumorszupresszor gének (TSG-k) mutációi jellemzik (Matthews et al., 2022). A különböző ráktípusok közül az emlőrák a leggyakoribb ráktípus a nőknél, és világszerte magas halálozási aránnyal rendelkezik (Waks és Winer, 2019). Az emlőrák heterogén betegség, változatos jellemzőkkel, mint például a szövettani és biológiai jellemzők, a klinikai megjelenés és viselkedés, valamint a kezelésre adott válasz (Weigelt et al., 2010). Az emlőrák osztályozása pontos betekintést nyújt az emlőrák diagnosztizálásába és a daganat prognózisába. A közös biomarkerek és klinikopatológiai jellemzők használata volt az emlőrák osztályozásának fő kritériuma (Tsang és Tse, 2019). Az emlőrák prognózisát és a kezelésre adott válaszát számos tényező befolyásolja, beleértve az ösztrogénreceptor (ER), a progeszteronreceptor (PR), a humán epidermális növekedési faktor receptor 2 (HER2/neu) jelenlétét, valamint a szövettani fokozatot, a tumor típusát és fokozatát, méretét és a nyirokcsomó-áttétet (Al-Tubaiti, 2020). Az emlőrák öt intrinsic molekuláris altípusát azonosították, beleértve a luminális A-t, a luminális B-t, a HER2-dúsított, a bazális-szerű és a claudin-low altípust (Prat et al., 2015). A TNBC a rák egy olyan molekuláris altípusa, amely nem expresszálja az összes ER-t, PR-t és HER2-t (Yin et al., 2020). Ezek a kóros jellemzők a TNBC-hez kapcsolódnak, megerősítve annak gyors progresszióját és agresszívabb természetét, mint bármely más típusú emlőrák (Feng et al., 2018). Ezenkívül Peru és munkatársai (2000) microarray technológiát alkalmaztak az emlőrák újraosztályozására és az emlőrák öt intrinsic altípusának azonosítására (Cadenas, 2012). A bazális-szerű emlőrák az emlőrák egy olyan altípusa, amelynek tripla-negatív fenotípusa van, és gyors progresszióval jár. Meg kell jegyezni, hogy minden bazális-szerű emlőrákot gyakran tévesen TNBC-ként diagnosztizálnak, de csak 77%-uk TNBC; Ezzel szemben a TNBC 71–91%-a bazális jellegű, ami arra utal, hogy az emlőrák e két típusa átfedésben van és eltérő osztályozásokat képvisel (Wang D.-Y. et al., 2019). Ez szükségessé teszi a TNBC heterogenitásának jellemzését a prognózis tisztázása és a jelenlegi és jövőbeli kezelésekre adott lehetséges válaszok azonosítása érdekében. Ezenkívül a TNBC az összes emlőrákos eset 15–20%-át teszi ki, és gyakoribb az 50 év alatti nőknél. A BRCA1 vagy BRCA2 mutációkat a TNBC esetek körülbelül 20%-ában jelentették (Xie et al., 2017; Tzikas et al., 2017). , 2020). Tanulmányok azt is kimutatták, hogy a TNBC jellegzetes immun mikrokörnyezettel rendelkezik, amely magában foglalja a vaszkuláris endoteliális növekedési faktorok, a tumorhoz kapcsolódó makrofágok (TAM-ok), a tumorba infiltrálódó limfociták (TIL-ek) és a tumor növekedésében és migrációjában részt vevő egyéb molekulák magas szintjét. Ezért a TNBC mikrokörnyezetének megértése kritikus fontosságú a prognózisa és a kezelése szempontjából (Fan és He, 2022).
A TNBC prognózisának felméréséhez és a hatékony kezelés biztosításához fontos a pontos diagnózis, amely főként immunhisztokémián (IHC) alapul az ER, PR és HER2 kimutatására, valamint mammográfián az emlődaganatok kimutatására. A mammográfia azonban nem képes megfelelően ábrázolni a tumoron belüli jellemzőket, például a nekrózist és a fibrózist (Deepak Singh et al., 2021). Mivel a rossz prognózis és diagnózis megakadályozza az orvosokat a megfelelő gyógyszerek felírásában (Chaudhary, 2020), különféle stratégiákat alkalmaznak a TNBC-s betegek ellátásának javítására. Jelenleg két gyógyszert, a doxorubicint és a ciklofoszfamidot alkalmazzák a TNBC-s betegeknél, és jó eredményeket mutattak. Ezenkívül más platinatartalmú gyógyszereket is alkalmaznak, például karboplatint és ciszplatint (Sikov et al., 2015). Ezenkívül a PARP-gátlókat, például az Olaparibot, a Velaparibot és a PF-01367338-at potenciális kemoterápiás gyógyszerként alkalmazták a TNBC kezelésére (Ishino et al., 2018). Mivel a Wnt/b-Catenin, NOTCH és Hedgehog jelátviteli útvonalak szerepéről beszámoltak a TNBC kialakulásában és progressziójában, a gyógyszerek ezen útvonalakra történő célzott adása fontos stratégia lehet (Aysola et al., 2013). Bár a műtét, a sugárterápia és a kemoterápia továbbra is a TNBC kezelésének fő eszközei, jelentős előrelépés történt az új kezelések fejlesztésében, beleértve a célzott terápiát, az immunterápiát, a különféle CRISPR-rel kapcsolatos génszerkesztő eszközöket, mint például a Cas9n, dCas9, CRISPR/Cas12, a prime szerkesztés és a CRISPR/Cas9-célzott génterápia. Itt a TNBC kezelésében alkalmazott különféle CRISPR-rel kapcsolatos génszerkesztő eszközökre fogunk összpontosítani. Ezek közül a CRISPR/Cas9 széles körű figyelmet kapott.
A Cas9n, más néven Cas9 nikáz, a Cas9 fehérje genetikailag módosított változata, amely a CRISPR/Cas9 genomszerkesztő rendszerből származik (Gupta et al., 2019). Eredeti formájában a Cas9 fehérje két nukleáz domént tartalmaz: RuvC-t és HNH-t, amelyek fő funkciója mindkét DNS-szál hasítása. A Cas9n-ben azonban az egyik nukleáz domén, a HNH, genetikailag mutálódik és inaktívvá válik. Ezért a Cas9n HNH doménje nem működik. Csak a RuvC domén marad aktív, lehetővé téve a Cas9n számára, hogy elvágja vagy megszakítsa az egyes DNS-szálakat (Trevino és Zhang, 2014). A Cas9-hez képest a Cas9n hatékonyan csökkentheti a célponton kívüli hatásokat és pontosan javíthatja a sejtek helyreállítási mechanizmusait. A Cas9n különféle problémák megoldására használható, például megszakítások létrehozására a kétszálú DNS meghatározott helyein. Erre a célra két Cas9n molekulát kombináltak és együtt használtak (Yee, 2016). A kevert vonalú kináz 3 (MLK3) egy mitogén által aktivált protein kináz, amely kulcsfontosságú szabályozóként szolgál a TNBC metasztázisa során (Cronan et al., 2012).
Az MLK3 több jelátviteli útvonalat is aktiválhat, amelyek TNBC áttétekhez vezetnek. Például a c-Jun N-terminális kináz (JNK) útvonal szabályozza a sejtek motilitását és az extracelluláris mátrix lebomlását, és az MLK3 aktiválja a JNK útvonalat, ezáltal fokozza a sejtek motilitását és invazív tulajdonságokat kölcsönöz a sejteknek (Rattanasinchai és Gallo, 2016). Az MLK3 az EMT-t is szabályozza. Ehhez olyan downstream transzkripciós faktorokat aktivál, mint a Snail, Slug és Twist. Ezek a faktorok gátolják az epiteliális markerek expresszióját és elősegítik a mezenchimális markerek expresszióját, ami áttétes fenotípus kialakulásához vezet (Casalino et al., 2023). Megfigyelték, hogy az MLK3 szerepet játszik az ECM átalakulásában és a proteázok, például a mátrix metalloproteinázok (MMP-k) aktiválásában, amelyek lebontják az ECM-et. Ez elősegíti a tumorsejtek invázióját és távoli helyekre való terjedését (Katari et al., 2019). Így a korábbi tanulmányok kimutatták, hogy az MLK3 kritikus szerepet játszik a TNBC-ben. Rattanasinchai és Gallo TNBC modelleket használtak az MLK3 szerepének tanulmányozására, és azt találták, hogy az specifikus jelátviteli útvonalakon keresztül elősegíti a rák kialakulását. CRISPR/Cas9n-t használtak az MLK3 szerkesztésére, és a TNBC metasztázisának jelentős csökkenését figyelték meg (Rattanasinchai és Gallo, 2016).
A dCas9, amelyet gyakran inaktív Cas9-nek is neveznek, a Cas9 fehérje módosított származéka. Az aktív Cas9-cel ellentétben a dCas9 nem rendelkezik endonukleáz aktivitással, így nem képes kettős szálú DNS töréseket indukálni. Ezért a dCas9 felhasználható a genom specifikus régióinak pontos megcélzására a DNS-szekvencia bármilyen megváltoztatása vagy módosítása nélkül (Wang et al., 2016). A dCas9-ben két endonukleáz fehérje, a RuvC és a HNH, inaktiválódik a fontos aminosav-maradékok elnyomásával. (Richter et al., 2016). Annak ellenére, hogy nem rendelkezik DNS-hasító aktivitással, a dCas9 számos fontos szerepet játszik a genetikai kutatásban és a biotechnológiában. Például lehetővé teszi a genom specifikus régióinak vizualizálását, elősegíti a transzkripciós szabályozást, és elősegíti az epigenetikai módosításokat (Brocken et al., 2018).
A ZEB1 transzkripciós faktor (cink ujj E-box kötő homeobox 1) specifikus és kritikus szerepet játszik az epiteliális-mezenchimális átmenet (EMT) közvetítésében, amely egy sejtes folyamat, amely az embrionális fejlődés, a szövetek regenerációja és a rák progressziója során zajlik. Magában foglalja az epiteliális sejtek mezenchimális sejtekké történő átalakulását, ami változásokat eredményez a sejtek morfológiájában, motilitásában, invázióképességében stb. (Wu et al., 2020). A ZEB1 több epiteliális markert is gátol, például az E-cadherint és az Occludint, amelyek felelősek a sejt-sejt adhézió és az epiteliális sejtek polaritásának fenntartásáért a TNBC-ben (Moreno-Bueno et al., 2008). Ezenkívül a ZEB1 aktivál bizonyos markereket, például az N-cadherint, a vimentint és a fibronektint (Konradi et al., 2014), és szabályozza a citoszkeletális átalakulásban részt vevő géneket is, mint például a Rho GTPázok és a mátrix metalloproteinázok (MMP-k) (Huang et al., 2014). 2022), továbbá számos jelátviteli útvonalra is hatással van, mint például a transzformáló növekedési faktor-β (TGF-β), a Wnt jelátvitel stb., ezáltal elősegítve a tumor invázióját és áttétképződését a TNBC-ben (Chen et al., 2016). Számos tanulmány és tudományos bizonyíték utal arra, hogy a ZEB1 nagy potenciállal rendelkezik, mint értékes szer a TNBC kimutatásában és terápiás beavatkozásában. Egy nemrégiben végzett tanulmányban Waryah és munkatársai TNBC modellt használtak, és a ZEB1 teljes elnyomását érték el a dCas9 által. Így nagyon magas specificitást és szinte teljes ZEB1 gátlást figyeltek meg in vivo körülmények között (Waryah et al., 2023).
A CRISPR/Cas12 egy CRISPR/Cpf1 nevű génszerkesztő eszköz. A CRISPR/Cas rendszerből származik, ahol a Cas12 kifejezés a CRISPR-hez kapcsolódó 12-es fehérjére utal (Bharathkumar et al., 2022), amely teljesen hasonló a Cas9-hez. Az egyetlen különbség az, hogy tartalmazza a Cas12 fehérjét. A Cas9-hez képest a Cas12 néhány egyedi funkcióval rendelkezik, például ragadós végeket hoz létre a génszerkesztési folyamat során, míg a Cas9 tompa végeket hoz létre (Wang et al., 2021). A Cas12 ezen tulajdonsága hozzájárul specifikus DNS-manipulációs technológiájához. Mivel a fehérje képes pontosan felismerni és elvágni a célpont DNS-t, rendkívüli sokoldalúsággal rendelkezik, így hatékony eszközzé válik számos alkalmazásban, beleértve a génszerkesztést is (Pickar-Oliver és Gersbach, 2019).
Más CRISPR-variánsokhoz hasonlóan a CRISPR/Cas12 is képes géneket kiütni vagy aktiválni a TNBC-ben, olyan géneket célozva meg, amelyek fontos szerepet játszanak a patogenezisében vagy a kezelésre adott válaszban (Yang és Zhang, 2023). Ennek a folyamatnak a megvalósításához egy vezető RNS-t (gRNS) fejlesztettek ki, amely a Cas12-t a célgénhez irányítja. Amint a Cas12 a célgénhez kötődik, kettős szálú töréseket hoz létre a DNS-ben, és aktiválja a DNS-javító mechanizmusokat. A javítási folyamat során helytelen nukleotidok is beépülhetnek, ami génmutációkhoz és funkcióvesztéshez vezethet (Zhang et al., 2021a). Ezenkívül a Cas12 enzim egy továbbfejlesztett változatát (dCas12-nek nevezik) is alkalmazták a gének aktiválására. Egy transzkripciós aktivátorral kombinálva bizonyos géneket indukálni, ezáltal aktiválni azokat. Ez a technológia nagy potenciállal rendelkezik a tumorszupresszor gének aktiválásának elősegítésében (Sultan et al., 2022).
Az elsődleges szerkesztés egy újonnan kifejlesztett és rendkívül fejlett genomszerkesztési technológia. Képes egy élőlény DNS-ének nagyon precíz módosítására (Chen és Liu, 2023). Az elsődleges szerkesztést két fő komponens integrációjával érik el: egy módosított CRISPR/Cas9 enzim és egy reverz transzkriptáz. A CRISPR/Cas9 enzim szerepe, hogy szelektíven célozza meg a genom pontos helyeit, míg a reverz transzkriptáz segít a DNS alapos módosításában a célhelyen (Hassan et al., 2021). A primer szerkesztési mechanizmusban az első lépés egy primer szerkesztési vezető RNS (pegRNS) létrehozása (Standage-Beier et al., 2021). Ez tartalmazza a célszekvenciát és a cél DNS kívánt szerkesztési helyének megfelelő RNS-templátot. A pegRNS-t ezután egy primer szerkesztő nukleázzal (PE2) együtt bejuttatják a célsejtekbe. A PE2 egy fúziós fehérje, amely egy Cas9 enzimből, egy reverz transzkriptázból és egy primer szerkesztő adapterből áll (Martín-Alonso et al., 2021). A sejten belül a pegRNS és a PE2 komplexek keresik a módosítani kívánt specifikus DNS-t. A Cas9 enzim elvágja a DNS-t, és egy egyetlen szálból álló templátot hoz létre (Choi et al., 2022). A reverz transzkriptáz ezt a templátot használja a DNS szerkesztésre való előkészítéséhez. A DNS másolásával együtt az RNS-templát szerkesztésére vonatkozó utasítások is szerepelnek. Végül az újonnan létrehozott DNS-szálat templátként használják a DNS-ben lévő törés javítására, ami egy megváltozott DNS-szekvenciát eredményez, amely a kívánt módosítást tartalmazza (Ochoa-Sanchez et al., 2021). A primer szerkesztési mechanizmusok széles körű mutációkhoz vezethetnek a génekben. Célozhatják a pontmutációkat, inszerciókat, deléciókat és akár a géncseréket is (Anzalone et al., 2019; Chen és Liu, 2023). A primer szerkesztés számos előnnyel jár a korábbi genomszerkesztési technológiákkal szemben. Ezek közé tartozik a megnövekedett pontosság, a csökkent offtarget hatások és a DNS szerkesztésének képessége a DNS kettős szálú töréseire való támaszkodás nélkül (Anzalone et al., 2020).
A CRISPR/Cas9 technológiát eredetileg a baktériumok plazmidátvitellel és fágfertőzéssel szembeni védelmére fejlesztették ki, majd később hatékony RNS-alapú DNS-célzó eszközként alkalmazták a genomszerkesztéshez (Jiang és Doudna, 2017). Ezenkívül a CRISPR/Cas9 rendszerről kimutatták, hogy a baktériumok és az archaeális genomok 50%-ában, illetve 87%-ában van jelen (Ishino et al., 2018). A CRISPR/Cas9 potenciális eszköz bármilyen rendellenes genetikai szekvencia deléciójára, inszerciójára és korrekciójára in vivo és in vitro módokban (Sabit et al., 2021). Ezenkívül kimutatták, hogy a CRISPR/Cas9 az adaptív immunrendszer része, mivel specifikus a célgénekre (Chen és Zhang, 2018).
A CRISPR/Cas9 a Cas9-ből és egyetlen vezető RNS-ből (sgRNS) áll. A Cas9 egy endonukleáz, amely több fehérjekomponensből áll. Ezenkívül a Cas9 egyedi szerkezeti és konformációs tulajdonságokkal rendelkezik (Pacesa et al., 2022), mivel két lebenyből áll: felismerő (REC) és nukleáz (NUC). A REC lebeny további három régióra oszlik: REC1, REC2 és híd hélixek (Cromwell et al., 2018). Az NUC három lebenyből áll, nevezetesen RuvC-ből (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH-ból és a protospacer szomszédos motívum (PAM) interakciós doménből (1. ábra) (Song et al., 2016). Az sgRNS két komponensből áll, beleértve a CRISPR RNS-t (crRNS) és a transzkódoló kis RNS-t (tracer RNS) (1. ábra). Az sgRNS a Cas9 fehérjét konnexinekhez köti, így egy aktív komplexet képez, más néven effektor komplexet (Richter et al., 2012). A crRNS egy 18-20 nukleotid hosszúságú bázispár, amely kritikus szerepet játszik a célpont DNS-szekvenciák felismerésében. Ezenkívül a crRNS párosodik a célpont DNS-sel, és a tracrRNS állványzatként működik a Cas9 nukleáz számára, hogy kötődjön a célpont DNS-hez (Manghwar et al., 2019). Másrészt a PAM szekvencia 3 nukleotidból áll, amely megerősíti, meghatározza és közvetíti az effektor komplex DNS-hez való kötődését. A Cas9 fehérjekomplex RuvC és HNH alegységei katalitikus aktivitással rendelkeznek (Richter et al., 2012; Asmamaw és Zawdie, 2021). A Cas9 alegység HNH nukleáz doménje hasítja a crRNS-hez kapcsolódó DNS-szálat. A RuvC nukleáz domén más DNS-szálakat hasít, és kettős szálú töréseket (DSB-ket) generál, ami után két különböző DNS-törésjavító mechanizmus aktiválódik (Jiang és Doudna, 2017) (1. ábra).
1. ábra. A CRISPR/Cas9 áttekintése (A). A CRISPR/Cas9 rendszer összetevői: (i). A Cas9 endonukleáz felelős a cél DNS-szekvencia elvágásáért, (ii) egyetlen vezető (sg) RNS, amely a crRNS és a tra-crRNS kimérák fúziójából származik. (kettő). A Cas9 számos komponenst tartalmaz, mint például a Rec I, Rec II, NUC lebeny (a HNH és a Ruv C alkomponensek) és a PAM interakciós domén (C) a megfelelő funkciókkal. A CRISPR/Cas9 fehérjekomplex a DNS-szekvenciákat nem komplementer és komplementer formákra hasítja (D). A CRISPR/Cas9 három lépésben szerkeszti a genomot: felismerés, vágás és javítás. A tervezett sg-RNS vezeti a Cas9-et, és a komplementer crRNS komponensen keresztül ismeri fel a kívánt szekvenciát. A Cas9 felismeri a PAM szekvenciát az 5′-NGG-3′ pozícióban, és megolvasztja a DNS-t, DNS-RNS hibridet képezve és aktiválva a hasítást. A Cas9 HNH doménje a komplementer szálat, a RuvC domén pedig a nem komplementer szálat hasítja. A CRISPR/Cas9 kétféleképpen javítja a dsDNS-t: nem homológ végcsatlakozással (NHEJ) és homológ módon történő javítással (HDR). Az NHEJ idegen homológ DNS hiányában enzimatikus folyamaton keresztül javítja a kétszálú DNS-t, egy hibalehetőségű mechanizmuson keresztül, amely véletlenszerű DNS-szekvenciákat képes beilleszteni vagy eltávolítani. A HDR nagyon specifikus és homológ DNS-sablonokat igényel.
A CRISPR/Cas9 által közvetített javító útvonalak közé tartoznak a nem homológ végcsatlakozások (NHEJ) és a homológirányított javítási (HDR) mechanizmusok. Az NHEJ egy hibára hajlamos útvonal, mivel inszerciót vagy deléciót foglal magában, és nem igényel semmilyen mintázatot a javító mechanizmus során. Véletlenszerű nukleotidokat használ standard fehérjék előállításához (Abbasi et al., 2021). Ez a javítórendszer négy komplexből áll, mint például a KU komplex, a 4-es típusú keresztkomplementáló fehérjekomplex (XRCC-4), a DNS-végfeldolgozó enzim és a protein kináz DNS-PKcs (Abbasi et al., 2021). A KU komplex fehérje két alegységgel rendelkezik, a Ku 70-nel és a Ku 80-nal, és fontos szerepet játszik az NHEJ mechanizmusában, mivel a javítómechanizmust két alegység (Ku 70 és Ku 80) kötődése indítja el a cél DNS tompa vagy majdnem tompa végéhez (Abbasi et al., 2021), ami állványzatként szolgál más NHEJ-vel kapcsolatos faktorok toborzásához a sérülés helyére (Yang et al., 2020). Az XRCC-4 és a DNS ligáz 334, illetve 911 aminosavból áll, az XRCC4-DNS ligáz IV komplex pedig serkenti a DNS-végek ligálását (Chatterjee et al., 2015). A DNS-végfeldolgozó enzim, más néven polinukleotid-kináz 3′-foszfát, egy DNS-végfeldolgozó enzim. Képes eltávolítani a DNS 3′P csoportját és foszforilálni az 5′OH csoportot a kettős szálú DNS-javítás során. Magában foglalja az egyszálú törések (SSB-k) javítását is az SSB javító útvonal segítségével (Chatterjee et al., 2015). A DNS-PKcs protein kináz egy DNS-függő protein kináz, amely a PIKK-k (foszfatidilinozitol-3-kináz-rokon kinázok) és az ataxia telangiektázia mutált (ATM) család katalitikus alegységéből, valamint az ATM-mel és Rad3-mal kapcsolatos ATR-ekből, száltörésekből (DSB-k) és egyszálú törésekből áll (Yue et al., 2020; Peng et al., 2016).
A HDR egy pontosabb és megfelelőbb javítómechanizmus, mivel az információ másolása a homológ DNS-duplex ép formájának felhasználásával történik, bár ehhez testvérkromatidák jelenléte szükséges. Ez az emlős sejtciklus S/G2 fázisában történik. A HDR főként élesztőfajokban fordul elő, de az NHEJ kritikus fontosságú az emlősöknél (Burma et al., 2006; Abbasi et al., 2021). A teljes javítómechanizmus az 1. ábrán látható.
Mivel a TNBC-t genetikai és epigenetikai rendellenességek okozzák, a rosszindulatú genomiális/epigenomikai rendellenességek CRISPR/Cas9 alkalmazásával történő korrekciója ésszerű terápiás megközelítés lehet (Chen et al., 2019). Ezenkívül a sejtspecifikus transzkripciós szabályozásban részt vevő egyes transzkripciós faktorok a rákos sejtek egyedi jellemzőit mutathatják, ami arra utal, hogy a transzkripciós szabályozás kiváló megközelítés lehet a rák kezelésében (Drost et al., 2017). A tumorok ezen molekuláris jellemzőinek, például a genetikai, epigenetikai és transzkripciós hibáknak a gyógyszerfejlesztésben való kihasználása javíthatja a klinikai eredményeket és csökkentheti a szűrés költségeit. A CRISPR egy potenciális génszerkesztő eszköz, amely nemcsak a rákot okozó genomiális célpontok kimutatására és azonosítására képes, hanem felhasználható az onkogének szerkesztésére, elnyomására és epigenetikai módosítására is emberi sejtekben (1. táblázat) (Ahmed et al., 2021). Számos CRISPR szűrést végeztek a tumorszupresszorokkal, onkogénekkel és gyógyszerrezisztenciával kapcsolatos gének keresésére. A CRISPR/Cas9 különböző TNBC onkogének szerkesztésére való felhasználását a 2. ábra mutatja.
2. ábra. Különböző TNBC onkogének génszerkesztése CRISPR/Cas9 segítségével, ami a tumor növekedésének és áttétképződésének csökkenéséhez vezetett. Ezek az onkogének közé tartozik a CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 és CXCR7, Crypto1, ROR1 és ST8SIA, amelyek szerepet játszanak a TNBC előfordulásában és áttétképződésében.
A ráksejtek migrációja, inváziója és epiteliális-mezenchimális átmenete (EMT) összefüggésben áll az ITGA9-cel. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy az ITGA9 kulcsszerepet játszik a Notch-útvonalban, és érdekes szerepet játszik a rabdomioszarkóma áttétképződésében (Molist et al., 2020). Ezenkívül az ITGA9 szorosan összefügg a betegek prognózisával számos tumortípusban, beleértve az emlőrákot is (Wang Z. et al., 2019). Az ITGA9 bioinformatikai elemzése kimutatta, hogy expressziója a TNBC-ben szignifikánsan magasabb volt, mint más emlőrák altípusokban. Az emelkedett ITGA9-szint a tumoráttétekkel és a kiújulással jár a TNBC-s betegeknél. Az ITGA9 CRISPR/Cas9 általi kiütése rákos őssejt-szerű tulajdonságokat, tumor angiogenezist, tumornövekedést és csökkent áttétképződést eredményezett a β-catenin lebontásának elősegítésével a TNBC-ben (Wang Z. et al., 2019).
A Crypto-1 a TGF-β család tagja, és kritikus fontosságú a korai embriogenezis, az őssejtek fenntartása és a rákáttétek kialakulásában (Ishii et al., 2021). Tdgf-1 néven is ismert, egy onkogén GPI-horgonyzott jelátviteli fehérje, amely részt vesz a primitív csík, a mezoderma és az endoderma kialakulásának szabályozásában, valamint a bal/jobb aszimmetria kialakulásában a szervek fejlődése során az embriogenezis során (Zhang et al., 2021b). Ezenkívül kimutatták, hogy a Cripto-1 őssejt-markerként részt vesz az epiteliális-mezenchimális átmenetben (EMT) (Zhang et al., 2021b). Az EMT nemcsak a különböző folyamatokban, például az embrionális fejlődésben, a fibrózisban és a sebgyógyulásban, hanem a rák inváziójában és áttétképződésében is kritikus fontosságú. Ezenkívül kimutatták, hogy a Cripto-1 kölcsönhatásba lép négy Notch receptorral, és fokozza azok poszttranszlációs érésüket (Brandstadter és Maillard, 2019). A Notch jelátviteli útvonalról ismert, hogy részt vesz az emberi emlőráksejtek fenntartásában. Tanulmányok kimutatták, hogy a CRISPR/Cas9 által közvetített Crypto-1 kiütés gátolja a rák növekedését és áttétképződését. Ezért a Crypto-1 fontos terápiás célponttá válhat a TNBC esetében (Castro et al., 2015).
Az XCL12 fehérje és kemokinreceptora, a CXC (CXCR4 és CXCR7) különböző szerepet játszanak a rákos sejtek proliferációjában, növekedésében, migrációjában és inváziójában (Wu et al., 2015). Ezeket a kemoreceptorokat több jelátviteli útvonalon keresztül hozták összefüggésbe a TNBC (TNBC) fejlődésével mind in vivo, mind in vitro modellekben (Wu et al., 2015). Ezenkívül a CXCR4 és a CXCR7 aktiválása a metasztázisra való nagyobb hajlammal és a rossz prognózissal jár a TNBC esetében (Karn et al., 2022). Ezért a CXCR4 és a CXCR7 kiütése hatékony gyógyszercélgénné válhat az emlőrák, beleértve a TNBC-t is, kezelésében. Yang és munkatársai (2019) tanulmányukban CRISPR/Cas9-et alkalmaztak a CXCR4 és CXCR7 gének együttes kiütésére, és azt találták, hogy a TNBC proliferációja, növekedése, migrációja és inváziója jelentősen gátolt (Yang et al., 2019).
Emlőrákos szövetekben megnövekedett miR-3662, egy TNBC onkogén szintjét figyelték meg (Yi et al., 2022). Kimutatták, hogy a miR-3662 expressziójának csökkentése gátolja az emlőrák növekedését és áttétképződését mind in vivo, mind in vitro (Agarwal és Gupta, 2021). A HBP-1 a Wnt/-catenin jelátvitel hatékony inhibitora, és valószínűleg felelős a miR-3662 által közvetített TNBC sejtek növekedéséért. Nemrégiben Yi és munkatársai kimutatták, hogy a miR-3662-HBP1 tengely szabályozza a Wnt/-catenin jelátviteli útvonalat a TNBC sejtekben (Yi et al., 2022). Tumorspecifikus expressziója miatt a miR-3662 potenciális terápiás célpont lehet a TNBC számára. Így a miR-3662 CRISPR/Cas9 által közvetített expressziója kiváló megközelítés lehet új gyógyszerek fejlesztéséhez a TNBC kezelésére.
Az UBR5 egy 300 kDa-os nukleofoszfoprotein, amelyet a tumorgenezis, az áttétképződés és az immunválasz kulcsfontosságú szabályozójaként azonosítottak különböző rákos megbetegedésekben (Shearer et al., 2015; Fu et al., 2023). Az UBR5-ről kimutatták, hogy nagymértékben fel van szabályozva a TNBC mintákban, és ubiquitin ligáz aktivitásán keresztül proliferációt indukálva serkenti az ERα funkciót (Bolt et al., 2015). Az elsődleges TNBC minták teljes exom szekvenálási vizsgálatai szintén kimutatták az UBR5 fokozott expresszióját, ami arra utal, hogy szerepet játszik a TNBC kialakulásában. Ezenkívül az UBR5 CRISPR/Cas9 által vezérelt deléciója jelentős gátlást mutatott a TNBC áttétképződésében és növekedésében kísérleti egérmodellekben. Továbbá az UBR5 vad típusú egérmodellbe történő beépítése visszaállította teljes funkcionalitását, míg ezt a hatást nem figyelték meg inaktivált mutáns törzsekben (Liao et al., 2017). Az UBR5 hiánya fokozott apoptózissal, nekrózissal és a tumornövekedés gátlásával jár a TNBC-ben a gyenge angiogenezis miatt. Az UBR5 elvesztése miatt a tumor távoli szervekbe való terjedése csökken, és az UBR5 abnormális EMT-t indukál, főként az E-cadherin expressziójának csökkentésével (Zhang és Weinberg, 2018). Nemrégiben kimutatták, hogy az UBR5 nagyon fontos tényező az IFN-γ által indukált PDL1 transzkripcióban TNBC-ben, mivel nem mutat E3 ubiquitinációs aktivitást. Az RNS-transzkriptom elemzés kimutatta, hogy az UBR5 szisztémás hatással lehet az IFN-γ útvonallal kapcsolatos génekre, és elősegítheti a PDL1 transzaktivációt a protein-kináz RNS (PKR) és jelátvivőinek és aktivátorainak, az 1-es transzkripciónak (STAT1) és az 1-es interferon szabályozó faktornak (IRF1) az aktivációs szintjének növelésével. Azonban az UBR5 és a PD-L1 expresszió CRISPR/Cas9 által közvetített kombinált ablációja szinergikus terápiás hatást fejt ki, mint bármelyik önmagában történő blokád, és mélyreható hatással van a tumor mikro-környezetére (Wu et al., 2022). Így a CRISPR/Cas9 fontos eszköz lehet az UBR5 funkciójának gátlására, ezáltal elnyomva a TNBC metasztázisát és a tumor növekedését.
Az ROR1 egy I. típusú transzmembrán fehérje, amely a rák és az embrionális fejlődés során expresszálódik, és onkofoetális fehérjeként azonosították (Nicholas Borcherding, 2014). Különböző emberi rákos megbetegedések invazív viselkedése összefüggésben áll az ROR1 felülszabályozásával. Ígéretes eredményeket kaptak az ROR1-et célzó terápiás vegyületekkel végzett in vivo és in vitro vizsgálatok (Chien et al., 2016). Az ROR1 mRNS emelkedett szintjét az emlőszövet-biopsziákban agresszív bazális-szerű emlő (BL) daganatokkal és azok más testrészekre történő migrációjával is összefüggésbe hozták. Ezenkívül az ROR1 túltermelését a TNBC kialakulásának prognosztikai markereként azonosították (Chien et al., 2016). Azonban a ROR1 CRISPR/Cas9 segítségével történő elnémítása a TNBC növekedésének és áttétképződésének elnyomása érdekében hatékony stratégia lenne.
A szialilációs folyamat során szialinsav kapcsolódik a glikokonjugátumokhoz, amit szialiltranszferázok (ST-k) katalizálnak. Az ST8SIA1 az ST családba tartozik, és fontos szerepet játszik számos betegség, például a limfocitás leukémia és a vastagbélrák patogenezisében (Chang et al., 2018). Az RNS-szekvenciaelemzés azt mutatja, hogy az ST8SIA1 magas szinten expresszálódik a TNBC-s betegek mellszövetében, és pozitív korrelációt mutat a p53 tumorszupresszor gén mutációival, ami hozzájárulhat a TNBC patogeneziséhez (Battula et al., 2017). Ezenkívül az ST8SIA1 részt vesz a TNBC áttétképződésében és kiújulásában, ami arra utal, hogy fontos szerepet játszik a TNBC előfordulásában és fejlődésében. Egy in vitro TNBC modellben kimutatták, hogy az ST8SIA1 CRIPSR/Cas9 általi gátlása blokkolja a növekedést és az áttétképződést (Battula et al., 2017). Ez arra utal, hogy a CRISPR/Cas9 fontos eszköz lehet az ST8SIA1 onkogén működésének gátlásában a TNBC kezelésében.
A NAT1 egy metabolikus enzim, amely katalizálja a II. fázisú xenobiotikus vegyületek képződését, és szinte minden emberi szövetben expresszálódik. A NAT1 a kofaktor folátot felhasználva képes megcélozni az acetil-CoA-t (acetil-CoA) még aromás amin szubsztrát hiányában is (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014). Tanulmányok kimutatták, hogy a NAT1 szabályozza a mátrix metalloproteináz 9 (MMP9) működését emlőráksejt-modellekben, és védelmet nyújt a reaktív oxigénfajták (ROS) ellen glükózéhség során (Wang et al., 2018). A NAT1 deléciója gátolja a piruvát-dehidrogenáz komplexet, ami mitokondriális diszfunkcióhoz vezet (Wang L. et al., 2019). Ezenkívül számos más jelentés is kimutatta, hogy a NAT1 gátlása kis molekulákkal és siRNA csendesítéssel csökkentheti az emlőráksejtek invázióját és proliferációját (Stepp et al., 2018). Nemrégiben a CRISPR/Cas9-et alkalmazták a NAT1 elnyomására az MDA-MB-231 emlőrák sejtvonalban, ami az expressziós szintjétől függően befolyásolta a sejtek anyagcseréjét. Ez a tanulmány azt is kimutatta, hogy a NAT-1 kritikus fontosságú a TNBC progressziójában és áttétképződésében (Carlisle et al., 2020).
Az onkogének koordinált transzkripcióját szuperenhanszerek, transzkripciós faktorok és kofaktorok szabályozzák (Hnisz et al., 2015). Ezenkívül a transzkripció szabályozásához ciklinfüggő kinázok (CDK) csoportja, mint például a CDK7, CDK8, CDK9, CDK12 és CDK13 szükséges. Ezek közül a CDK7 részt vesz az RNS polimeráz II foszforilációjában, ami nagyon fontos az onkogén transzkripció megindításához és kiterjedéséhez a TNBC patogenezisében. Egy alapvető tanulmányban a CDK7 CRISPR/Cas9 általi deléciója gátolta a TNBC-t, ami arra utal, hogy a TNBC patogenezise CDK7-függő (Wang Y. et al., 2015).
Tanulmányok kimutatták, hogy a MYC és az RBP (RNS-kötő fehérje) mutációi apoptózishoz vezethetnek, míg a MYC vagy az RBP egyetlen génmutációi nem befolyásolják a rákos sejtek növekedését (Einstein et al., 2021). Több mint 1000 RBP-t szűrtek az emberi genomban CRISPR/Cas9-alapú könyvtár segítségével. Közülük 57 RBP-t találtak kritikusnak a magas MYC-szintű rákos sejtek növekedéséhez (Wheeler et al., 2020). Ezenkívül az YTHDF2 fontos a TNBC sejtek növekedésének fenntartásához, és csökkenti a metilált transzkriptumok mennyiségét a magas szintű transzkripció és transzláció során a magasabb MYC-expressziójú rákos sejtekben. Továbbá az YTHDF2 nem esszenciális a rákos sejtek számára, amelyek kevésbé függenek a megemelkedett MYC-szintektől a TNBC-betegek túlélésének meghosszabbításához (Einstein et al., 2021), ami arra utal, hogy potenciális terápiás célpont lehet a TNBC-t leküzdeni képes gyógyszerek számára.
A cinkujjfehérjék (ZNF-ek) a teljes emberi genom körülbelül 1%-át teszik ki. Tanulmányok kimutatták, hogy a ZNF szabályozhatja a sejtek proliferációját különböző rákos megbetegedésekben, például májrákban, emlőrákban és vastagbélrákban (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017). A CRISPR knockout által létrehozott könyvtárakat különféle tumorszupresszor gének (TSG-k) szűrésére használták emlőráksejtekben (Shalem et al., 2014). Azóta a CRISPR/Cas9 ZNF319-deletált emlőráksejtek transzkriptomikai vizsgálata kimutatta, hogy a ZNF319 egy tumorszupresszor gén, amely csökkenti az emlőrák proliferációját, és ezért részt vesz különböző potenciális jelátviteli mechanizmusokban és más biológiai funkciókban (Wang L. et al., 2022).
A ferroptózis a programozott sejthalál egy típusa, amely a vas jelenlététől függ. Ismert, hogy a ferroptózis kialakulását befolyásolja a lipid-peroxidok jelenléte. Ezenkívül a PKCβII-ről kimutatták, hogy korai lipidperoxidációt mutat, és a fokozott lipidperoxidáció összefüggésben áll a ferroptózissal. A CRISPR/Cas9-közvetített kináz inhibitorok könyvtárának szűrése kimutatta, hogy a PKCβII részt vesz a lipidperoxidáció folyamatában, ami kritikus fontosságú a ferroptózis szempontjából az MDA-MB-231 sejtekben (Zhang et al., 2022). Ez arra utal, hogy a PKCβII CRISPR/Cas9 általi kiütése potenciális tumorszupresszor géncélpont lehet a ferroptózissal összefüggő betegségek kezelésében (Zhang et al., 2022).
Úgy vélik, hogy a gyógyszerrezisztencia a rákos betegek halálozásának körülbelül 90%-áért felelős, és a rákkezelés egyik fő kihívása (Bukowski et al., 2020). Az eredmények azt mutatják, hogy elegendő számú, a gyógyszereffluxhoz, a DNS-javításhoz, az apoptózishoz és a különféle sejtes jelátviteli útvonalakhoz kapcsolódó gén kapcsolódik a gyógyszerrezisztenciához (Haider et al., 2020). Ezek közül számos gént céloztak meg CRISPR/Cas9 eszközökkel, és ígéretes eredményeket mutattak a gyógyszerrezisztencia csökkentésében és a rákellenes kezelések hatékonyságának növelésében (Vaghari-Tabari et al., 2022). Ezenkívül a nagy áteresztőképességű CRISPR/Cas9 génkiütéses szűrőkönyvtárakat a potenciális gyógyszerrezisztencia géncélpontok funkciójának módosításában is szerepet játszottak (Shalem et al., 2015). A paklitaxel-rezisztencia gének azonosításához RNS-szekvenálást és genomszintű sgRNS-könyvtár-szűrést alkalmaztak nyolc jelöltgén, köztük a hiszton-dezacetiláz 9 (HDAC9) azonosítására, amelyek a gyógyszerrezisztenciával járnak a visszatérő TNBC-ben szenvedő betegeknél (B et al., 2020). Egy másik tanulmányban a diszerin/treonin és tirozin protein kináz (DSTYK) fokozott expresszióját figyelték meg rákellenes gyógyszerekkel kezelt TNBC-betegek túlélése során. Ezenkívül a CRISPR/Cas9 által közvetített DSTYK gátlás jelentősen fokozta a gyógyszerrezisztens rákos sejtek apoptózisát in vitro (SUM102PT sejtek és MDA-MB-468 sejtek) és egy in vivo TNBC modellben (Ogbu et al., 2021).
Bár a TNBC-ben a MAPK-útvonal rendellenesen aktiválódik, a MEK-célzott terápiák klinikai hatása gyenge. Egy CRISPR/Cas9 genomkönyvtár-szűrés kimutatta, hogy a PSMG2 (proteom összeszerelési chaperon 2) gátlása érzékennyé teszi a TNBC BT549 és MB468 sejteket az AZD6244 MEK-gátlóval szemben. A PSMG2 CRISPR/Cas9 általi leállítása megváltoztatta a normál proteaszómafunkciót, ami az autofágia által közvetített PDPK1 szétszereléséhez vezetett, ezáltal tovább javítva a tumorsejteket az AZD6244 (MEK-gátló) és az MG132 (proteaszóma-gátló) által indukált TNBC egérmodellekben. Így a proteaszóma és a MAP-kináz (MEK) inhibitorok szinergikusan alkalmazhatók a tumorsejtek proliferációjának csökkentése érdekében (Wang X. et al., 2022).
A CRISPR/Cas9-et a TNBC-rezisztenciához vezető génfunkció-vesztés szűrésére is alkalmazták (Shu et al., 2020). Ge és munkatársai elmagyarázták a JQ1-gyel, egy BET-brómdomén-gátlóval (BBDI) kezelt rákos sejtek gyógyszerrezisztenciájának mechanizmusát TNBC-ben. CRISPR/Cas9 segítségével azt találták, hogy az rb1 gén deléciója a TNBC rezisztenssé válását okozza a JQ1 rákellenes gyógyszerrel szemben. Ezért az rb1 funkciója fontos a JQ1 gyógyszerekre adott válaszban TNBC-ben. Azt is közölték, hogy a paklitaxel egy CDK4/6 kináz/mikrotubulus inhibitor, és a BBDI-kkel, például a JQ1-gyel való kombinációja ígéretes terápiás válaszokat adhat a gyógyszerrezisztens TNBC-re (Ge et al., 2020).
A hosszú, nem kódoló RNS (lncRNS) transzkripciós környezete felelős a neoadjuváns terápiával szembeni rezisztenciáért TNBC-ben. Ez a tanulmány kimutatta, hogy öt különböző MALAT1 lncRNS transzkriptum magas expressziót mutat a TNBC-ben. Ezenkívül a MALAT1 CRISPR/Cas9 által közvetített deléciója növelte a TNBC BT-549 sejtek érzékenységét a paklitaxellel és a doxorubicinnel szemben, ami a MALAT1 rezisztencia lehetséges szerepére utal a TNBC-ben (Shaath et al., 2021).
A BRCA1 (BRCA1m) mutációi heterogének, ezért nehezen kimutathatók. A PARP1 (poli(ADP-ribóz) polimeráz), a BRCA1 szintetikus letális partnerének célzása növelheti a TNBC gyógyszer-kemoérzékenységét. CRISPR/Cas9 alkalmazásával a PARP1 deléciója növelte a rákellenes gyógyszerek, például a doxorubicin, a gemcitabin és a docetaxel érzékenységét az mBRCA1 mutáns TNBC sejtekkel szemben, ami arra utal, hogy a PARP1 szintén szerepet játszik a gyógyszerrezisztenciában a TNBC-ben (Vaghari-Tabari et al., 2022). A BRCA1 vagy BRCA2 tumorszupresszor gének mutációiról ismert, hogy növelik az emlőrák kialakulásának valószínűségét emberekben. Ezen betegek kezelése PARP-gátlók alkalmazását igényli. Ezenkívül kimutatták, hogy a DNPH1 nukleotid-mentő faktor CRISPR/Cas9 alkalmazásával történő kiütése eltávolíthatja a toxikus 5-hidroximetildezoxiuridin (hmdU)-monofoszfát nukleotidot, ezáltal fokozva a BRCA-hiányos sejtek PARP-gátlókkal szembeni érzékenységét (Fugger et al., 2021). Így a CRISPR/Cas9 és PARP1 inhibitorok fontos kezelési stratégiává válhatnak a TNBC esetében.
A penetráns glikoprotein (P-gp) gén egy többszörös gyógyszerrezisztencia gén, amely általában a TNBC körülbelül 41%-ában fel van szabályozva (Sun et al., 2020). A P-gp által indukált gyógyszereffluxot az emlőrákban a gyógyszerrezisztencia egyik kulcsfontosságú szabályozójaként azonosították. A P-gp inhibitorok fokozott érzékenységet mutattak a rákellenes gyógyszerekkel szemben emlőrákban (Famta et al., 2021). Így a CRISPR/Cas9 által közvetített P-gp és P-gp inhibitorok ablációja vagy elnyomása nagyon fontos módszer lehet a gyógyszerrezisztencia leküzdésére a TNBC-ben.
Az ATP-kötő kazettás transzporter G2 (ABCG2) ismerten gyógyszerrezisztenciát okoz TNBC-ben (Palasuberniam et al., 2015), bár jelenleg nincsenek jelentések a CRISPR/Cas9 és az ABCG2 elnémítása, valamint a tumorszupresszor gén inaktivációja közötti kapcsolatról. A PTEN fokozhatja az ABCG2 aktivációját (Palasuberniam et al., 2015), (Deepak Singh et al., 2021). Ezért a CRISP/Ca9 használata az ABCG2 eltávolítására és egy ABCG2 inhibitorral kombinálva megfelelő kezelés lehet a gyógyszerrezisztencia leküzdésére TNBC-ben. A 2. táblázat a CRISPR/Cas9-et említi, amely az összes rezisztencia gént célozza meg.
2. táblázat. A CRISPR/Cas9 különböző TNBC rezisztencia géneket céloz meg, hogy érzékenyebbé tegye a sejteket a rákellenes gyógyszerekkel szemben.
A CRISPR/Cas9 könyvtárak potenciális eszközök a rák patogenezisével kapcsolatos génmutációk szűrésére (Chan et al., 2022). Ez a szűrési módszer négy lépésből áll, nevezetesen (a) könyvtárépítés, (b) lentivirális transzdukció, (c) fenotípusos szűrés és (d) célgén-elemzés. Bár a TNBC-ben a MAPK-útvonal rendellenesen aktiválódik, a MEK-célzott terápia klinikai prognózisa nagyon rossz a tumorszupresszor génekben, például a PTEN-ben, az RB1-ben és a TP53-ban mutációkat hordozó TNBC-betegek esetében.
Ezenkívül egy CRISPR/Cas9 génkiütéses szűrés tesztelte a leghatékonyabb és legszelektívebb molekulát, a dehidrokatrolt, amely nagy mennyiségben megtalálható a guatemalai virág- és levélkivonatokban, hogy megértse a dehidrokatrol MDA-MB-231-re gyakorolt hatását. A szelektív sejtcitotoxicitás mechanizmusai. A TNBC altípusok mezenchymális szár jellemzői. Ez a CRISPR/Cas9 alapú szűrés azt is kimutatta, hogy a HSD17B11, a 11-es típusú 17β-hidroxiszteroid dehidrogenázt kódoló gén, magas szinten expresszálódik az MDA-MB-231 sejtekben, és az MDA-MB-231 sejtekre specifikus dehidrofalkarinolt eredményez (Grant et al., 2020). Ez tehát arra utal, hogy a CRISPR/Cas9 genomiális szűrés nagy potenciállal rendelkezik a potenciális természetes vegyületek rákellenes tulajdonságai mögött meghúzódó mechanizmusok azonosításában.
Ezenkívül a TNBC rákkal szembeni érzékenységét egy objektív, genomszintű in vivo CRISPR/Cas9 szűréssel vizsgálták, amely kapcsolatot mutatott ki az onkogén és a tumorszupresszor útvonalak között. Az mTOR és Hippo útvonalak kulcskomponenseiről kimutatták, hogy fontos szerepet játszanak a tumorszabályozásban a TNBC-ben. Ezenkívül tanulmányok kimutatták, hogy az mTORC1/2 és a YAP onkoprotein farmakológiai gátlása hatékonyan gátolja a TNBC patogenitását egy in vitro gyógyszer-mátrix szinergia modell és in vivo betegből származó xenograftok alkalmazásával. Továbbá, a Torin-1 által közvetített mTORC1/2 gátlás fokozza a makropinocitózist, míg a verteporfin által indukált YAP gátlás a TNBC sejthalálához vezet. Összefoglalva, ezek az eredmények rávilágítanak a genomszintű in vivo CRISPR szűrés erejére és robusztusságára a TNBC új és hatékony kezeléseinek azonosításában (Dai et al., 2021).
Az immunrendszer szabályozási zavara fontos tényező a tumorgenezisben. A rákos sejtek az immunrendszer általi kiürülést úgy kerülik el, hogy megkerülik a védekező mechanizmusokat, beleértve az immunsejtek aktivitásának zavarását a tumor mikroklímájában és az immunrendszer gyengítését. Ezért egy továbbfejlesztett immunrendszer kifejlesztése kulcsfontosságú megközelítés lehet a tumorok elleni küzdelemben. A CRISPR/Cas9-alapú génmódosítás alkalmazása számos, az immunrendszer működési zavarával kapcsolatos problémát kezel különböző nézőpontokból. A CRISPR/Cas9-et az alábbi útvonalakon keresztül alkalmazták az emlőrák elleni tumorellenes immunitás javítására (3. ábra).
3. ábra. A CRISPR/Cas9 immunterápia a TNBC sejteket célozza meg. A CDK5 elvesztése, valamint a PDL1 és CD155 gátlása fokozza az immunrendszert. Hasonlóképpen, az A2AR elvesztése és a TAA-k, például a HER2, a mucin 1 és a TEM8 gátlása növelte a CAR-T sejtek hatékonyságát a rákos sejtek elpusztításában. A CRISPR/Cas9 által módosított T-sejtek szűrése kimutatta, hogy a p38 kináz gátlása fokozza a T-sejtek daganatellenes aktivitását. A CRISPR/Cas9 által módosított T-sejtek növelik a TCR (T-sejt receptor) expresszióját, ami a T-sejtek daganatellenes aktivitását eredményezi.
Az immunterápia célja az immunrendszer stimulálása a rákos sejtek megtámadására. Az immunellenőrzőpont-fehérjék túltermelése általában megakadályozza az autoimmun reakciókat, de segíthet a rákos megbetegedéseknek elkerülni azokat (Topalian et al., 2015). Ezek a fehérjék az immunsejtek felszínén lévő receptorokhoz kötődve akadályozzák meg az immunreakciókat. Több ellenőrzőpont-fehérje (például a CD155 és a PD-L1) az immunsejtek PD-1 receptorát célozza meg, és emlőrákban, különösen a TNBC-ben expresszálódik (Li Y.-C. et al., 2020). A PD-L1 vagy receptorának CRISPR/Cas9 segítségével történő gátlása stimulálhatja az immunrendszert a TNBC-tumorok megtámadására (Yahata et al., 2019). Ezenkívül kimutatták, hogy a PD-L1 expressziójának CRISPR/Cas9 által közvetített CDK5 deléción keresztüli csökkentése in vitro és in vivo is gátolja a tumornövekedést (Deng et al., 2020). Az emlőrák in vitro és in vivo modelljeiben tapasztalt növekedésgátlás arra utal, hogy a CD155 shRNS-közvetített redukciója terápiás hatással lehet az emlőrákra (Gao et al., 2018).
A CAR T-sejtek olyan CAR-okat expresszálnak, amelyek felismerik a tumor-asszociált antigéneket (TAA-k), és az ellenőrzőpontfehérjék kiütését (knockdown) felhasználhatják aktivitásuk fokozására (Li C. et al., 2020). Az emlőrákban a CAR T-sejtterápia számos potenciális célpontja van, beleértve számos TAA-t, mint például a HER2, a mucin1 és a TEM8 (Bajgain et al., 2018). Bizonyítékok vannak arra, hogy a mezotelint célzó CAR T-sejtek (amelyek túltermelődnek a TNBC BT-459 sejtekben) hatékonyabbak a rák ellen, ha a PD-1-et CRISPR/Cas9 segítségével kiütik (Hu et al., 2019). A T-sejtek izolálása a betegekből, majd ex vivo szerkesztése azonban munkaigényes és időigényes folyamat. Bár az univerzális T-sejtek csökkenthetik az izolálási követelményeket, a humán leukocita antigén (HLA) I. osztályú és T-sejt receptort (TCR) expresszáló donor T-sejteket el kell távolítani a graft-versus-host rendellenességek megelőzése érdekében (Ren et al., 2017a). A CRISPR/Cas9 használatával a HDR egyidejűleg képes eliminálni a TCR-t és a HLA-t, valamint kiütni a CAR-t kódoló gént. Tanulmányok kimutatták, hogy a CRISPR/Cas9 segítségével anti-CD19 CAR-ok juttathatók be a TCR lókuszba, ezáltal hatékonyan termelve a CAR-okat a T-sejtek számának csökkenése nélkül (Dimitri et al., 2022). Multiplex technológiákat fejlesztettek ki allogén CAR T-sejtek előállítására a TCR, a béta-2-mikroglobulin (B2M), a HLA-I alegység és más fehérjék, például a PD-1 és a CTLA-4 egyidejű eliminálásával, amelyek nagyobb rákellenes tulajdonságokkal rendelkezhetnek a TNBC-vel szemben (Eyquem et al., 2017; Liu et al., 2017; Ren et al., 2017b; Dimitri et al., 2022).
A CRISPR/Cas9 használata javíthatja a CAR-T-sejtek hatékonyságát. Az adenozinról ismert, hogy immunszuppresszív tulajdonságokkal rendelkezik, és csökkentheti a rákellenes immunitást a T-sejtek működésének blokkolásával és az adenozin A2A receptorok (A2AR) aktiválásával (Vigano et al., 2019). Az A2AR CRISPR/Cas9 segítségével történő elnémítása jelentősen javította a CAR-T-sejtek hatékonyságát in vivo (Giuffrida et al., 2021). A T-sejtekről ismert, hogy különféle fenotípusos jellemzőket mutatnak, mint például a sejtszaporodás, a differenciálódás, az oxidatív stressz és a genomiális stressz. A CRISPR/Cas9-alapú T-sejt-szűrés 25 különböző T-sejt-receptor-kináz zavarát tárta fel. Ezek közül a p38-kináz deléciója fokozza a T-sejtek daganatellenes aktivitását, ami arra utal, hogy a p38-kináz a CAR-T-sejtek szabályozásának kulcsfontosságú szabályozója (Gurusamy et al., 2020).
A T-sejtek genetikailag módosíthatók CRISPR/Cas9 segítségével, így magas expressziójú TCR-eket (TCR-eket) lehet előállítani. A genetikailag módosított T-sejtek betegekbe történő beültetése erősebb rákellenes aktivitást mutatott, mint az endogén T-sejtek. Ezért az endogén TCR-ek versenghetnek a genetikailag módosított TCR-ekkel a betegekben, ami befolyásolhatja a rák immunterápiájának lehetőségeit. E probléma leküzdésére a CRISPR/Cas9 használata az endogén TCR-β eltávolítására a recipiens sejtekből, majd a TCR-β T-sejtek rákos betegekbe történő beültetése jobb rákellenes immunválaszt mutathat endogén TCR szexuális versengés nélkül (Fan et al. 2018). Így a CRISPR-módosított T-sejtek kivételével a TCR-ek ezerszer érzékenyebbek a tumor antigénekre, mint a normál TCR-transzdukált T-sejtek. Ezenkívül különböző leukémiákban a γδ TCR+ CRISPR által generált módosított T-sejtek a CD4+ és CD8+ T-sejtek magasabb expresszióját mutatják, mint a standard TCR-transzfer (Legut et al., 2018). Így a CRISPR/Cas9 által generált módosított T-sejtek hatékony immunterápiás módszert jelenthetnek a TNBC leküzdésére.
Az integrinek sejtadhéziós molekulák, amelyek jelen vannak a sejtek transzmembránjaiban, és elősegítik a sejtek kötődését az extracelluláris mátrixhoz (ECM) (Hamidi és Ivaska, 2018). Az integrinek szabályozási zavara a rák kialakulásával és migrációjával jár az extracelluláris mátrix megváltoztatásával, ami a ráksejtek túléléséhez vezet a keringésben (Hamidi és Ivaska, 2018). A CRISPR/Cas9 által közvetített integrin leállása lassítja a tumor progresszióját, áttétképződését és kolonizációját TNBC-ben. Az integrin α5 (ITGA5) leállásáról kimutatták, hogy csökkenti a sejtek migrációját és progresszióját más rákos megbetegedésekben, például a tüdőrákban (Ju et al., 2017), ami arra utal, hogy az integrin α5 szintén kulcsfontosságú tényező lehet a TNBC patogenezisében.
A hagyományos embrionális őssejt (ES) sejtekből származó knockout egerek létrehozása munkaigényes, időigényes és nem hatékony folyamat. Hónapokba, sőt évekbe telik, mire az ES sejteket homológ rekombinációval célozzák meg, kiméra egereket tenyésztenek, majd heterozigóta egerekkel keresztezik homozigóta utódok létrehozása céljából. Komplex keresztezésre van szükség ahhoz, hogy több genetikai mutációval rendelkező egereket hozzanak létre. Azonban számos probléma merül fel, amikor olyan egereket használnak, amelyeket CRISPR/Cas9 segítségével ES sejtek ablációjával vagy CRISPR/Cas9 komponensek egysejtű megtermékenyített petesejtekbe történő mikroinjekciójával hoznak létre. Például a változások bevezetése gyakran biallelikus lokuszokon történik, és nem génspecifikus. Nemrégiben arról számoltak be, hogy a CRISPR/Cas9 technológiát alkalmazó ES sejtek egyszerre akár 5 génbe is képesek biallelikus mutációkat beilleszteni (Nishizono et al., 2021). Erre a célra Cas9 mRNS-t és öt génspecifikus gRNS-t transzfektáltak egyidejűleg ES sejtekbe. Ez kiemeli az eljárás ígéretét és hatékonyságát, bár ezek a mutációk továbböröklődhettek, amikor az alapító vonalakat ötszörös knockout egerek előállítására tenyésztették. A tanulmány egy meglepő felfedezésről is beszámol: az ES sejtek már nem szükségesek a genetikailag módosított egerek létrehozásához. Ehelyett specifikus géntermékek eltávolítása érdekében Cas9 mRNS-t és gRNS-t injektáltak egysejtű embriókba. Ennek eredményeként olyan „kiütött” alapító vonalakat hoztak létre, amelyek elméletileg felhasználhatók az egerekben a géndeléció következményeinek tanulmányozására (Qin et al., 2016). Így a CRISPR/Cas9 lehetővé teszi transzgénikus egerek létrehozását a TNBC kezelésére, alacsonyabb költségek mellett, mint a hagyományos géntechnológia. A CRISPR/Cas rendszer segítségével egy új „kiütött” egérmodellt fejlesztettek ki, amely sikeresen képes pontmutációkat bevinni egy vagy több endogén génbe a TNBC-ben. Ezen koncepció alapján a TNBC állatmodelljei is kifejleszthetők a BRCA1 és a p53 CRISPR/Cas9 által közvetített deléciójával, ami a HR-javítás elvesztéséhez, genomiális instabilitáshoz és mutáns fenotípusokhoz vezet (Annunziato et al., 2020).
Jelenleg különféle módszereket, például mammográfiát, mágneses rezonancia képalkotást (MRI) és ultrahangot alkalmaznak a TNBC diagnosztizálására. Ezeknek a módszereknek azonban vannak korlátai. A mammográfiát a lokális emlőszövet diagnosztizálására használják, nem pedig az áttétek kimutatására, ahol a rákos sejtek más szervekbe vándoroltak. Az ultrahangvizsgálat nem megbízható módszer a TNBC diagnosztizálására (Chen és Lee-Felker, 2023). Az MRI érzékenyebb, mint az ultrahang és a mammográfia, de diagnosztikai pontossága korlátozott (Sha és Chen, 2022). A szövetbiopszia invazív módszer a rákos sejtek azonosítására. Bizonyos esetekben azonban a biopszia nem mutathat ki rákos szövetet, ha a tű eltávolodik a vizsgált területtől. Ráadásul nagyon drága, és traumatikus lehet a beteg számára. A TNBC egy heterogén típusú rák, így a biopszia nem feltétlenül nyújt elegendő információt a rák típusáról. Ezért sürgősen szükség van egy új, diagnosztikailag megbízható módszerre a TNBC kimutatására. A CRISPR/Cas9 egy nagyon érzékeny és minimálisan invazív alternatíva lehet az emlőrák diagnosztizálásában. Ennek érdekében a CRISPR/Cas9-alapú stratégiák alkalmazhatók a TNBC diagnosztizálására szolgáló PCR-módszerek fejlesztésére. Először a CRISPR rendszer Cas9 és cpf1 fehérjéit használják a nem specifikus DNS eltávolítására, majd ez a két fehérje (Cas9 és cpf1) felismeri a PAM szekvenciát, mielőtt a célzott DNS-hez kötődne (Deepak Singh et al., 2021). Így a PCR képes azonosítani a rák kialakulásával összefüggő mutációkat. Számos tanulmány alkalmazta ezt a CRISPR-alapú stratégiát különböző mutációk kimutatására különböző rákos megbetegedésekben (Safari et al., 2019). Így a CRISPR-alapú PCR-módszerek csökkenthetik a TNBC diagnózisának függőségét az invazív módszerektől, például a biopszián alapuló immunhisztokémiától.
A hormonreceptor-szabályozás genotípusos változásait TNBC-ben is kimutatták (Chen és Russo, 2009). A CRISPR/Cas9-alapú PCR-stratégiák, amelyek mikroarray-eket használnak az ellátás helyszíni diagnosztikájánál, hatékonyan monitorozhatják ezeket a mutációkat (Hajian et al., 2019). Ez releváns információkkal is szolgálhat az egészségügyi szolgáltatók számára a TNBC-s betegek specifikus mutációiról, ami segíthet a kezelésük javításában. Ennek a kombinált technikának azonban vannak korlátai. Ezért kiterjedt kutatási erőfeszítésekre van szükség, mielőtt ezt a CRISPR/Cas-PCR módszert az egészségügyben a TNBC diagnosztizálására lehetne alkalmazni (Yang et al., 2019).
Közzététel ideje: 2024. október 14.