A komputertomográfiával (CT) azonosított tüdőcsomók differenciáldiagnózisa továbbra is kihívást jelent a klinikai gyakorlatban. Jelen tanulmányban 480 szérumminta globális metabolomját jellemezzük, beleértve az egészséges kontrollokat, a jóindulatú tüdőcsomókat és az I. stádiumú tüdőadenokarcinómát. Az adenokarcinómák egyedi metabolomikai profilokat mutatnak, míg a jóindulatú csomók és az egészséges egyének metabolomikai profiljai nagy hasonlóságot mutatnak. A felfedező csoportban (n = 306) 27 metabolitból álló készletet azonosítottak a jóindulatú és a rosszindulatú csomók megkülönböztetésére. A diszkrimináns modell AUC-értéke a belső validációs (n = 104) és a külső validációs (n = 111) csoportokban 0,915, illetve 0,945 volt. Az útvonalanalízis a tüdőadenokarcinóma szérumában a jóindulatú csomókhoz és az egészséges kontrollokhoz képest megnövekedett glikolitikus metabolitokat mutatott ki, amelyek a triptofán csökkent szintjével jártak együtt, és arra utalt, hogy a triptofán felvétele elősegíti a glikolízist a tüdőráksejtekben. Tanulmányunk kiemeli a szérum metabolit biomarkerek értékét a CT-vel kimutatott tüdőcsomók kockázatának felmérésében.
A korai diagnózis kritikus fontosságú a rákos betegek túlélési arányának javítása érdekében. Az Egyesült Államok Nemzeti Tüdőrák Szűrési Vizsgálatának (NLST) és az Európai NELSON Tanulmány eredményei kimutatták, hogy az alacsony dózisú komputertomográfiával (LDCT) végzett szűrés jelentősen csökkentheti a tüdőrák okozta halálozást a magas kockázatú csoportokban1,2,3. Az LDCT tüdőrákszűrésre való széles körű alkalmazása óta az aszimptomatikus tüdőcsomók véletlenszerű radiológiai leleteinek előfordulása folyamatosan növekszik4. A tüdőcsomók legfeljebb 3 cm átmérőjű fokális opacitásokként definiálhatók5. Nehézségekkel szembesülünk a rosszindulatú daganatok valószínűségének felmérése és az LDCT-n véletlenül észlelt nagyszámú tüdőcsomó kezelése során. A CT korlátai gyakori kontrollvizsgálatokhoz és álpozitív eredményekhez vezethetnek, ami szükségtelen beavatkozáshoz és túlkezeléshez vezethet6. Ezért szükség van megbízható és hasznos biomarkerek kifejlesztésére a tüdőrák korai stádiumban történő helyes azonosítására, és a legtöbb jóindulatú csomó megkülönböztetésére a kezdeti felismeréskor7.
A vér (szérum, plazma, perifériás vér mononukleáris sejtjei) átfogó molekuláris elemzése, beleértve a genomikát, a proteomikát vagy a DNS-metilációt8,9,10, egyre nagyobb érdeklődést váltott ki a tüdőrák diagnosztikai biomarkereinek felfedezése iránt. Eközben a metabolomikai megközelítések az endogén és exogén hatások által befolyásolt sejtes végtermékeket mérik, és ezért alkalmazzák a betegség kialakulásának és kimenetelének előrejelzésére. A folyadékkromatográfia-tandem tömegspektrometria (LC-MS) széles körben használt módszer a metabolomikai vizsgálatokban nagy érzékenysége és nagy dinamikus tartománya miatt, amely képes lefedni a különböző fizikai-kémiai tulajdonságokkal rendelkező metabolitokat11,12,13. Bár a plazma/szérum globális metabolomikai elemzését alkalmazták a tüdőrák diagnózisával14,15,16,17 és a kezelés hatékonyságával kapcsolatos biomarkerek azonosítására18, a jóindulatú és rosszindulatú tüdőcsomók megkülönböztetésére szolgáló szérum metabolit-osztályozók még sokat kutatottak. - hatalmas kutatások.
Az adenokarcinóma és a laphámsejtes karcinóma a nem kissejtes tüdőrák (NSCLC) két fő altípusa. Különböző CT-szűrővizsgálatok azt mutatják, hogy az adenokarcinóma a tüdőrák leggyakoribb szövettani típusa1,19,20,21. Ebben a vizsgálatban ultrahangos folyadékkromatográfiás-nagyfelbontású tömegspektrometriát (UPLC-HRMS) alkalmaztunk metabolomikai elemzésre összesen 695 szérummintán, beleértve az egészséges kontrollokat, a jóindulatú tüdőcsomókat és a CT-vel kimutatott ≤3 cm-es mintákat. I. stádiumú tüdő adenokarcinóma szűrése. Azonosítottunk egy szérummetabolit-panelt, amely megkülönbözteti a tüdő adenokarcinómát a jóindulatú csomóktól és az egészséges kontrolloktól. Az útvonal-dúsulási elemzés kimutatta, hogy a kóros triptofán- és glükózanyagcsere gyakori elváltozások a tüdő adenokarcinómában a jóindulatú csomókhoz és az egészséges kontrollokhoz képest. Végül létrehoztunk és validáltunk egy nagy specificitású és érzékenységű szérummetabolikus osztályozót, amely megkülönbözteti az LDCT által kimutatott rosszindulatú és jóindulatú tüdőcsomókat, ami segíthet a korai differenciáldiagnózisban és a kockázatértékelésben.
A jelenlegi vizsgálatban 174 egészséges kontrollszemélytől, 292 jóindulatú tüdőcsomóval rendelkező betegtől és 229 I. stádiumú tüdőadenokarcinómában szenvedő betegtől gyűjtöttek nem és életkor szerint illesztett szérummintákat retrospektíven. A 695 alany demográfiai jellemzőit az 1. kiegészítő táblázat mutatja.
Amint az 1a. ábrán látható, összesen 480 szérummintát, köztük 174 egészséges kontrollt (HC), 170 jóindulatú gócot (BN) és 136 I. stádiumú tüdő adenokarcinóma (LA) mintát gyűjtöttek a Sun Yat-sen Egyetem Rákközpontjában. Felfedező kohorsz a nem célzott metabolomikai profilalkotáshoz ultrateljesítményű folyadékkromatográfia-nagy felbontású tömegspektrometria (UPLC-HRMS) segítségével. Amint az 1. kiegészítő ábrán látható, az LA és HC, LA és BN közötti differenciális metabolitokat azonosították egy osztályozási modell létrehozása és a differenciális útvonalelemzés további vizsgálata érdekében. A Sun Yat-sen Egyetem Rákközpontja által gyűjtött 104 mintát és két másik kórház által gyűjtött 111 mintát belső, illetve külső validálásnak vetettek alá.
a A felfedező kohorsz vizsgálati populációja, amelyen globális szérum metabolomikai analízist végeztek ultrateljesítményű folyadékkromatográfia-nagy felbontású tömegspektrometriával (UPLC-HRMS). b A vizsgálati kohorsz 480 szérummintájának teljes metabolomjának részleges legkisebb négyzetek diszkrimináns analízise (PLS-DA), beleértve az egészséges kontrollokat (HC, n = 174), a jóindulatú göböket (BN, n = 170) és az I. stádiumú tüdő adenokarcinómát (Los Angeles, n = 136). +ESI, pozitív elektrospray ionizációs mód, -ESI, negatív elektrospray ionizációs mód. c–e A két adott csoportban szignifikánsan eltérő mennyiségben előforduló metabolitokat (kétoldalú Wilcoxon előjeles rangpróba, téves felfedezési arányhoz igazított p-érték, FDR <0,05) pirossal (változás > 1,2) és kékkel (változás < 0,83) jelöltük. ) a vulkán grafikonon. f Hierarchikus klaszterezési hőtérkép, amely az LA és a BN közötti annotált metabolitok számának jelentős különbségeit mutatja. A forrásadatok forrásadatfájlok formájában vannak megadva.
A felfedező csoportban a 174 HC, 170 BN és 136 LA teljes szérummetabolitjait UPLC-HRMS analízissel elemeztük. Először is bemutatjuk, hogy a minőségellenőrzési (QC) minták szorosan csoportosulnak egy felügyelet nélküli főkomponens-analízis (PCA) modell középpontjában, megerősítve a jelenlegi vizsgálat teljesítményének stabilitását (2. kiegészítő ábra).
Amint az az 1b. ábrán látható parciális legkisebb négyzetek módszerén alapuló diszkrimináns analízisben (PLS-DA) látható, azt találtuk, hogy egyértelmű különbségek voltak az LA és a BN, valamint az LA és a HC között pozitív (+ESI) és negatív (-ESI) elektrospray ionizációs módban. Azonban nem találtunk szignifikáns különbséget a BN és a HC között +ESI és -ESI körülmények között.
382 differenciális jellemzőt találtunk az LA és a HC, 231 differenciális jellemzőt az LA és a BN, valamint 95 differenciális jellemzőt a BN és a HC között (Wilcoxon előjeles rangpróba, FDR <0,05 és többszörös változás >1,2 vagy <0,83) (1c-e ábra). . A csúcsokat tovább annotáltuk (3. kiegészítő adat) egy adatbázissal (mzCloud/HMDB/Chemspider könyvtár) szemben m/z érték, retenciós idő és fragmentációs tömegspektrum keresés alapján (részletek a Módszerek részben)22. Végül 33, illetve 38 annotált metabolitot azonosítottunk, amelyek mennyisége szignifikánsan eltért az LA és a BN esetében (1f. ábra és 2. kiegészítő táblázat), illetve az LA és a HC esetében (3. kiegészítő ábra és 2. kiegészítő táblázat). Ezzel szemben a BN és a HC esetében csak 3, szignifikáns mennyiségben eltért metabolitot azonosítottunk (2. kiegészítő táblázat), ami összhangban van a BN és a HC közötti átfedéssel a PLS-DA-ban. Ezek a differenciális metabolitok a biokémiai anyagok széles skáláját lefedik (4. kiegészítő ábra). Összefoglalva, ezek az eredmények jelentős változásokat mutatnak a szérum metabolitjaiban, amelyek a korai stádiumú tüdőrák rosszindulatú transzformációját tükrözik a jóindulatú tüdőcsomókhoz vagy az egészséges alanyokhoz képest. Eközben a BN és a HC szérum metabolitjainak hasonlósága arra utal, hogy a jóindulatú tüdőcsomók számos biológiai jellemzővel rendelkezhetnek az egészséges egyénekkel. Tekintettel arra, hogy az epidermális növekedési faktor receptor (EGFR) génmutációk gyakoriak a 23-as altípusú tüdő adenokarcinómában, megvizsgáltuk a driver mutációk hatását a szérum metabolitjaira. Ezután elemeztük a tüdő adenokarcinóma csoportban 72 EGFR státuszú eset teljes metabolomikai profilját. Érdekes módon a PCA-analízis során hasonló profilokat találtunk az EGFR mutáns betegek (n = 41) és az EGFR vad típusú betegek (n = 31) között (5a. kiegészítő ábra). Azonban 7 olyan metabolitot azonosítottunk, amelyek mennyisége szignifikánsan megváltozott az EGFR mutációval rendelkező betegekben a vad típusú EGFR-rel rendelkező betegekhez képest (t-próba, p < 0,05 és a változás mértéke > 1,2 vagy < 0,83) (5b. kiegészítő ábra). Ezen metabolitok többsége (7-ből 5) acilkarnitinek, amelyek fontos szerepet játszanak a zsírsav-oxidációs útvonalakban.
Amint a 2a. ábrán látható munkafolyamatban látható, a göbök osztályozására szolgáló biomarkereket a legkisebb abszolút zsugorodási operátorok és a LA-ban (n = 136) és a BN-ben (n = 170) azonosított 33 differenciális metabolit alapján történő szelekció segítségével kaptuk meg. A változók legjobb kombinációja (LASSO) – bináris logisztikus regressziós modell. A modell megbízhatóságának tesztelésére tízszeres keresztvalidációt alkalmaztunk. A változók kiválasztását és a paraméterek regularizációját egy λ24 paraméterrel rendelkező valószínűségi maximalizációs büntetéssel korrigáltuk. A diszkrimináns modell osztályozási teljesítményének tesztelésére globális metabolomikai elemzést végeztünk a belső validációs (n = 104) és a külső validációs (n = 111) csoportokban függetlenül. Ennek eredményeként a felfedező halmazban lévő 27 metabolitot azonosítottuk a legjobb diszkrimináns modellként, a legnagyobb átlagos AUC-értékkel (2b. ábra), amelyek közül 9-nek fokozott, 18-nak pedig csökkent aktivitása volt LA-ban a BN-hez képest (2c. ábra).
Munkafolyamat pulmonális góc osztályozó felépítéséhez, beleértve a legjobb szérum metabolitok paneljének kiválasztását a felfedezési halmazban egy bináris logisztikus regressziós modell segítségével tízszeres keresztvalidáción keresztül, valamint a prediktív teljesítmény értékelését belső és külső validációs halmazokban. b A LASSO regressziós modell keresztvalidációs statisztikái metabolikus biomarker kiválasztására. A fenti számok az adott λ mellett kiválasztott biomarkerek átlagos számát jelentik. A piros pontozott vonal az átlagos AUC-értéket jelöli a megfelelő lambda mellett. A szürke hibasávok a minimális és maximális AUC-értékeket jelölik. A szaggatott vonal a legjobb modellt jelzi a 27 kiválasztott biomarkerrel. AUC, a ROC (Receiver Operating Characteristic) görbe alatti terület. c A 27 kiválasztott metabolit változása az LA csoportban a felfedezési csoport BN csoportjához képest. Piros oszlop – aktiváció. A kék oszlop csökkenést jelez. d–f A ROC (Receiver Operating Characteristic) görbék a diszkrimináns modell teljesítményét mutatják a felfedezési, belső és külső validációs halmazokban lévő 27 metabolit-kombináció alapján. A forrásadatok forrásadatfájlok formájában vannak megadva.
Egy predikciós modellt hoztak létre ezen 27 metabolit súlyozott regressziós együtthatói alapján (3. kiegészítő táblázat). Az ezen 27 metaboliton alapuló ROC-analízis 0,933 görbe alatti területet (AUC), 0,868 felfedezőcsoport-érzékenységet, 0,859 specificitást és 0,859-et eredményezett (2d. ábra). Eközben a 38 annotált LA és HC differenciális metabolit közül 16 metabolitból álló csoport 0,902 AUC-értéket, 0,801 érzékenységet és 0,856 specificitást ért el az LA és a HC megkülönböztetésében (6a-c. kiegészítő ábra). A differenciális metabolitok különböző küszöbértékein alapuló AUC-értékeket is összehasonlították. Azt tapasztaltuk, hogy az osztályozási modell a LA és a BN (HC) megkülönböztetésében akkor teljesített a legjobban, amikor a küszöbértéket 1,2-re, 1,5-re vagy 2,0-ra állították be (7a,b. kiegészítő ábra). A 27 metabolitcsoporton alapuló osztályozási modellt belső és külső kohorszokban tovább validálták. Az AUC 0,915 volt (érzékenység 0,867, specificitás 0,811) a belső validáció és 0,945 (érzékenység 0,810, specificitás 0,979) a külső validáció esetében (2e., f. ábra). A laboratóriumok közötti hatékonyság felméréséhez a külső kohortból származó 40 mintát elemeztek egy külső laboratóriumban a Módszerek részben leírtak szerint. Az osztályozási pontosság 0,925 AUC-t ért el (8. kiegészítő ábra). Mivel a tüdő laphámsejtes karcinóma (LUSC) a nem kissejtes tüdőrák (NSCLC) második leggyakoribb altípusa a tüdő adenokarcinóma (LUAD) után, a metabolikus profilok validált potenciális hasznosságát is teszteltük. BN és 16 LUSC eset. A LUSC és a BN közötti megkülönböztetés AUC-értéke 0,776 volt (9. kiegészítő ábra), ami a LUAD és a BN közötti megkülönböztetéshez képest gyengébb képességet jelez.
Tanulmányok kimutatták, hogy a CT-felvételeken látható csomók mérete pozitív korrelációt mutat a rosszindulatú daganatok valószínűségével, és továbbra is a csomók kezelésének egyik fő meghatározója25,26,27. A NELSON szűrővizsgálat nagyszámú résztvevőjéből származó adatok elemzése azt mutatta, hogy az 5 mm-nél kisebb nyirokcsomókkal rendelkező alanyoknál a rosszindulatú daganatok kockázata hasonló volt a nyirokcsomók nélküli alanyoknál28. Ezért a rendszeres CT-monitorozást igénylő minimális méret 5 mm, a Brit Mellkasi Társaság (BTS) ajánlása szerint, és 6 mm, a Fleischner Társaság ajánlása szerint29. Azonban a 6 mm-nél nagyobb és nyilvánvaló jóindulatú jellemzők nélküli csomók, az úgynevezett meghatározatlan tüdőcsomók (IPN), továbbra is jelentős kihívást jelentenek a klinikai gyakorlatban az értékelés és a kezelés során30,31. Ezután megvizsgáltuk, hogy a csomó mérete befolyásolja-e a metabolomikus jellemzőket, a felfedezési és a belső validációs kohorszokból származó összevont minták felhasználásával. 27 validált biomarkerre összpontosítva először összehasonlítottuk a 6 mm-nél kisebb HC és BN metabolomok PCA profiljait. Azt tapasztaltuk, hogy a HC és a BN adatpontjainak többsége átfedésben volt, ami azt mutatja, hogy a szérum metabolitszintjei hasonlóak voltak mindkét csoportban (3a. ábra). A különböző mérettartományokban a jellemzőtérképek konzerváltak maradtak a BN és az LA esetében (3b., c. ábra), míg a 6–20 mm-es tartományban elkülönülést figyeltünk meg a rosszindulatú és jóindulatú csomók között (3d. ábra). Ennek a kohorsznak az AUC-je 0,927, specificitása 0,868, érzékenysége pedig 0,820 volt a 6–20 mm-es csomók malignusságának előrejelzésében (3e., f. ábra). Eredményeink azt mutatják, hogy az osztályozó képes rögzíteni a korai malignus transzformáció által okozott metabolikus változásokat, a csomó méretétől függetlenül.
ad PCA profilok összehasonlítása meghatározott csoportok között 27 metabolit metabolikus osztályozója alapján. CC és BN < 6 mm. b BN < 6 mm vs BN 6–20 mm. LA 6–20 mm vs. LA 20–30 mm-ben. g BN 6–20 mm és LA 6–20 mm. GC, n = 174; BN < 6 mm, n = 153; BN 6–20 mm, n = 91; LA 6–20 mm, n = 89; LA 20–30 mm, n = 77. e ROC görbe, amely a diszkrimináns modell teljesítményét mutatja 6–20 mm-es csomók esetén. f A valószínűségi értékeket a logisztikus regressziós modell alapján számítottuk ki 6–20 mm-es csomók esetén. A szürke szaggatott vonal az optimális határértéket (0,455) jelöli. A fenti számok a Los Angelesre előrejelzett esetek százalékos arányát jelentik. Használjon kétoldalú Student-féle t-próbát. PCA, főkomponens-analízis. AUC görbe alatti terület. A forrásadatok forrásadatfájlok formájában vannak megadva.
Négy, hasonló méretű (7–9 mm) tüdőgöböt mutató mintát (44–61 évesek) választottak ki tovább a javasolt malignitás-előrejelzési modell teljesítményének szemléltetésére (4a., b. ábra). A kezdeti szűrés során az 1. eset tömör gócként jelentkezett meszesedésekkel, ami a jóindulatúsággal járó jellemző, míg a 2. eset meghatározatlan, részben tömör gócként jelentkezett, nyilvánvaló jóindulatú jellemzők nélkül. Három CT-vizsgálati kör azt mutatta, hogy ezek az esetek 4 éven keresztül stabilak maradtak, ezért jóindulatú gócoknak tekintették őket (4a. ábra). A sorozatos CT-vizsgálatok klinikai értékelésével összehasonlítva a jelenlegi osztályozó modellel végzett egyszeri szérum metabolit-elemzés gyorsan és helyesen azonosította ezeket a jóindulatú gócokat a valószínűségi korlátok alapján (1. táblázat). A 4b. ábra a 3. esetben egy pleurális retrakció jeleivel rendelkező gócot mutat, ami leggyakrabban malignitással társul32. A 4. eset meghatározatlan, részben tömör gócként jelentkezett, jóindulatú okra utaló bizonyíték nélkül. Az osztályozó modell szerint mindezeket az eseteket malignusnak jósolták (1. táblázat). A tüdő adenokarcinóma diagnózisát tüdőreszekciós műtét utáni hisztopatológiai vizsgálattal igazolták (4b. ábra). A külső validációs halmaz esetében a metabolikus osztályozó pontosan előrejelezte a 6 mm-nél nagyobb, határozatlan tüdőcsomók két esetét (10. kiegészítő ábra).
Két jóindulatú göbös eset tüdő axiális ablakának CT-felvételei. Az 1. esetben a 4 év elteltével végzett CT-vizsgálat egy stabil, 7 mm-es, tömör gócot mutatott meszesedésekkel a jobb alsó lebenyben. A 2. esetben az 5 év elteltével végzett CT-vizsgálat egy stabil, részben tömör, 7 mm átmérőjű gócot mutatott a jobb felső lebenyben. b Két I. stádiumú adenokarcinóma eset tüdő axiális ablakos CT-felvételei és a megfelelő patológiai vizsgálatok. A 3. eset egy 8 mm átmérőjű gócot mutatott a jobb felső lebenyben, pleurális retrakcióval. A 4. eset egy 9 mm-es, részben tömör, mattüveg gócot mutatott a bal felső lebenyben. A reszekált tüdőszövet hematoxilin-eozin (H&E) festése (skála = 50 μm) a tüdő adenokarcinóma acináris növekedési mintázatát mutatja. A nyilak a CT-képeken észlelt gócokat jelzik. A H&E képek a patológus által vizsgált több (>3) mikroszkópos mező reprezentatív képei.
Összefoglalva, eredményeink a szérum metabolit biomarkerek potenciális értékét mutatják a tüdőcsomók differenciáldiagnózisában, ami kihívást jelenthet a CT-szűrés értékelése során.
Egy validált differenciális metabolit panel alapján a főbb metabolikus változások biológiai korrelátumait kerestük. A MetaboAnalyst által végzett KEGG útvonal-dúsulási elemzés 6 közös, szignifikánsan megváltozott útvonalat azonosított a két adott csoport között (LA vs. HC és LA vs. BN, korrigált p ≤ 0,001, hatás > 0,01). Ezeket a változásokat a piruvát-anyagcsere, a triptofán-anyagcsere, a niacin- és nikotinamid-anyagcsere, a glikolízis, a TCA-ciklus és a purin-anyagcsere zavarai jellemezték (5a. ábra). Ezután célzott metabolomikai vizsgálatokat végeztünk a főbb változások abszolút kvantifikációval történő ellenőrzésére. A gyakran megváltozott útvonalakban található közös metabolitok meghatározása tripla kvadrupól tömegspektrometriával (QQQ) történt autentikus metabolit standardok felhasználásával. A metabolomikai vizsgálat célmintájának demográfiai jellemzőit a 4. kiegészítő táblázat tartalmazza. Globális metabolomikai eredményeinkkel összhangban a kvantitatív elemzés megerősítette, hogy a hipoxantin, a xantin, a piruvát és a laktát szintje megemelkedett LA-ban a BN-hez és a HC-hez képest (5b., c. ábra, p <0,05). Azonban ezekben a metabolitokban nem találtak szignifikáns különbséget a BN és a HC között.
A KEGG útvonal dúsulási elemzése szignifikánsan eltérő metabolitok esetében az LA csoportban a BN és HC csoportokhoz képest. Kétoldali Global tesztet alkalmaztunk, és a p-értékeket Holm-Bonferroni módszerrel korrigáltuk (korrigált p ≤ 0,001 és hatásméret > 0,01). b–d A Violin diagramok a hipoxantin, xantin, laktát, piruvát és triptofán szinteket mutatják a szérum HC, BN és LA LC-MS/MS-sel meghatározva (n = 70 csoportonként). A fehér és fekete szaggatott vonalak a mediánt, illetve a kvartilist jelzik. e A Violin diagram az SLC7A5 és QPRT normalizált Log2TPM (transzkriptumok/millió) mRNS expresszióját mutatja tüdő adenokarcinómában (n = 513) a normál tüdőszövethez (n = 59) képest a LUAD-TCGA adatkészletben. A fehér doboz az interkvartilis tartományt, a középen lévő vízszintes fekete vonal a mediánt, a dobozból kinyúló függőleges fekete vonal pedig a 95%-os konfidencia intervallumot (CI) jelöli. f Az SLC7A5 és GAPDH expressziójának Pearson-féle korrelációs diagramja tüdő adenokarcinómában (n = 513) és normál tüdőszövetben (n = 59) a TCGA adatkészletben. A szürke terület a 95%-os konfidencia intervallumot jelöli. r, Pearson-féle korrelációs együttható. g Normalizált sejtes triptofán szintek nem specifikus shRNS kontrollal (NC) és shSLC7A5-tel (Sh1, Sh2) transzfektált A549 sejtekben, LC-MS/MS-sel meghatározva. Öt biológiailag független minta statisztikai elemzését mutatjuk be minden csoportban. h A NADt sejtes szintjei (teljes NAD, beleértve a NAD+-t és NADH-t) A549 sejtekben (NC) és SLC7A5 knockdown A549 sejtekben (Sh1, Sh2). Három biológiailag független minta statisztikai elemzését mutatjuk be minden csoportban. i Az A549 sejtek glikolitikus aktivitását az SLC7A5 knockdown előtt és után extracelluláris savasodási sebességgel (ECAR) mértük (n = 4 biológiailag független minta csoportonként). 2-DG,2-dezoxi-D-glükóz. A (b–h) ábrán kétoldali Student-féle t-próbát alkalmaztunk. A (g–i) ábrán a hibasávok az átlagot ± SD-t jelölik, minden kísérletet háromszor, egymástól függetlenül végeztünk el, és az eredmények hasonlóak voltak. A forrásadatokat forrásadatfájlok formájában adjuk meg.
Figyelembe véve a megváltozott triptofán-anyagcsere jelentős hatását az LA csoportban, QQQ segítségével a HC, BN és LA csoportokban is meghatároztuk a szérum triptofánszintjét. Azt tapasztaltuk, hogy a szérum triptofánszintje alacsonyabb volt az LA csoportban a HC vagy a BN csoporthoz képest (p < 0,001, 5d. ábra), ami összhangban van a korábbi eredményekkel, miszerint a keringő triptofánszint alacsonyabb a tüdőrákos betegeknél, mint a kontrollcsoport egészséges kontrollcsoportjában33,34,35. Egy másik, PET/CT nyomjelzővel, 11C-metil-L-triptofánnal végzett vizsgálat kimutatta, hogy a triptofán jel retenciós ideje a tüdőrákszövetben szignifikánsan megnőtt a jóindulatú elváltozásokhoz vagy a normál szövethez képest36. Feltételezzük, hogy a triptofán szintjének csökkenése az LA szérumban a tüdőráksejtek aktív triptofánfelvételét tükrözheti.
Az is ismert, hogy a triptofán katabolizmus kinurenin útvonalának végterméke a NAD+37,38, amely fontos szubsztrát a gliceraldehid-3-foszfát és az 1,3-biszfoszfoglicerát glikolízisben történő reakciójához39. Míg a korábbi tanulmányok a triptofán katabolizmus immunszabályozásban betöltött szerepére összpontosítottak, mi a jelenlegi vizsgálatban megfigyelt triptofán szabályozási zavar és a glikolitikus útvonalak közötti kölcsönhatást vizsgáltuk. Az oldott transzporter család 7. tagja, az 5. számú (SLC7A5) ismert, hogy egy triptofán transzporter43,44,45. A kinolinsav-foszforiboziltranszferáz (QPRT) egy enzim, amely a kinurenin útvonal alsóbb szakaszán található, és a kinolinsavat NAMN-né alakítja46. A LUAD TCGA adatkészlet vizsgálata kimutatta, hogy mind az SLC7A5, mind a QPRT szignifikánsan fel volt szabályozva a tumorszövetben a normál szövethez képest (5e. ábra). Ez a növekedés a tüdő adenokarcinóma I. és II., valamint III. és IV. stádiumában volt megfigyelhető (11. kiegészítő ábra), ami a triptofán-anyagcsere korai zavarait jelzi a tumorgenezissel összefüggésben.
Ezenkívül a LUAD-TCGA adatkészlet pozitív korrelációt mutatott az SLC7A5 és a GAPDH mRNS expressziója között rákos betegek mintáiban (r = 0,45, p = 1,55E-26, 5f. ábra). Ezzel szemben nem találtak szignifikáns korrelációt az ilyen génsignatúrák között normál tüdőszövetben (r = 0,25, p = 0,06, 5f. ábra). Az SLC7A5 gén leállítása (12. kiegészítő ábra) az A549 sejtekben szignifikánsan csökkentette a sejtek triptofán- és NAD(H)-szintjét (5g., h. ábra), ami a glikolízis aktivitásának csökkenéséhez vezetett, amit az extracelluláris savasodási sebességgel (ECAR) mértek (1. ábra). 5i. Így a szérum metabolikus változásai és az in vitro detektálás alapján feltételezzük, hogy a triptofán anyagcseréje NAD+-t termelhet a kinurenin útvonalon keresztül, és fontos szerepet játszhat a glikolízis elősegítésében tüdőrákban.
Tanulmányok kimutatták, hogy a LDCT által kimutatott nagyszámú, meghatározatlan tüdőcsomó további vizsgálatok, például PET-CT, tüdőbiopszia és a rosszindulatú daganat álpozitív diagnózisa miatti túlkezelés szükségességéhez vezethet.31 Amint a 6. ábra mutatja, tanulmányunkban azonosítottunk egy olyan szérummetabolit-panelt, amely potenciális diagnosztikai értékkel bír, és javíthatja a CT-vel kimutatott tüdőcsomók kockázatbecslését és későbbi kezelését.
A tüdőcsomókat alacsony dózisú komputertomográfiával (LDCT) vizsgálják, a képalkotó jellemzők jóindulatú vagy rosszindulatú okokra utalnak. A csomók bizonytalan kimenetele gyakori kontrollvizsgálatokhoz, szükségtelen beavatkozásokhoz és túlkezeléshez vezethet. A diagnosztikai értékű szérum metabolikus osztályozók bevonása javíthatja a kockázatértékelést és a tüdőcsomók későbbi kezelését. PET pozitronemissziós tomográfia.
Az amerikai NLST-tanulmány és az európai NELSON-tanulmány adatai arra utalnak, hogy a magas kockázatú csoportok alacsony dózisú komputertomográfiával (LDCT) történő szűrése csökkentheti a tüdőrák okozta halálozást1,3. Azonban az LDCT által észlelt nagyszámú véletlenszerű tüdőcsomó kockázatértékelése és az azt követő klinikai kezelése továbbra is a legnagyobb kihívást jelenti. A fő cél a meglévő LDCT-alapú protokollok helyes osztályozásának optimalizálása megbízható biomarkerek beépítésével.
Bizonyos molekuláris biomarkereket, például a vér metabolitjait, tüdőrákos betegek és egészséges kontrollszemélyek összehasonlításával azonosítottak15,17. Jelen tanulmányunkban a szérum metabolomikai analízis alkalmazására összpontosítottunk, hogy megkülönböztessük a jóindulatú és rosszindulatú tüdőcsomókat, amelyeket véletlenül észleltek az LDCT. UPLC-HRMS analízis segítségével összehasonlítottuk az egészséges kontrollszemélyek (HC), a jóindulatú tüdőcsomók (BN) és az I. stádiumú tüdő adenokarcinóma (LA) minták globális szérum metabolomját. Azt találtuk, hogy a HC és a BN hasonló metabolikus profillal rendelkezett, míg az LA szignifikáns változásokat mutatott a HC-hez és a BN-hez képest. Két szérum metabolitcsoportot azonosítottunk, amelyek megkülönböztetik az LA-t a HC-től és a BN-től.
A jóindulatú és rosszindulatú csomók jelenlegi LDCT-alapú azonosítási sémája főként a csomók méretén, sűrűségén, morfológiáján és időbeli növekedési ütemén alapul30. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a csomók mérete szorosan összefügg a tüdőrák valószínűségével. Még a magas kockázatú betegeknél is <1% a rosszindulatú daganatok kockázata a 6 mm-nél kisebb csomókban. A 6-20 mm-es csomók rosszindulatú daganatainak kockázata 8% és 64% között mozog30. Ezért a Fleischner Társaság 6 mm-es határátmérőt javasol a rutin CT-követéshez.29 A 6 mm-nél nagyobb, meghatározatlan tüdőcsomók (IPN) kockázatértékelését és kezelését azonban nem végezték el megfelelően31. A veleszületett szívbetegségek jelenlegi kezelése általában a várakozáson és a gyakori CT-monitorozáson alapul.
A validált metabolom alapján elsőként mutattuk ki a metabolomikai jellemzők átfedését egészséges egyének és a 6 mm-nél kisebb jóindulatú csomók között. A biológiai hasonlóság összhangban van a korábbi CT-eredményekkel, amelyek szerint a 6 mm-nél kisebb csomók rosszindulatúságának kockázata ugyanolyan alacsony, mint a csomó nélküli alanyoknál.30 Meg kell jegyezni, hogy eredményeink azt is mutatják, hogy a 6 mm-nél kisebb és ≥6 mm-es jóindulatú csomók metabolomikai profiljai nagy hasonlóságot mutatnak, ami arra utal, hogy a jóindulatú etiológia funkcionális definíciója a csomó méretétől függetlenül konzisztens. Így a modern diagnosztikai szérum metabolit panelek egyetlen vizsgálatot biztosíthatnak kizáró tesztként, amikor a csomókat kezdetben CT-n észlelik, és potenciálisan csökkenthetik a sorozatos monitorozást. Ugyanakkor ugyanazon metabolikus biomarker panel megkülönböztette a 6 mm-nél nagyobb méretű rosszindulatú csomókat a jóindulatú csomóktól, és pontos előrejelzést adott a hasonló méretű és kétértelmű morfológiai jellemzőkkel rendelkező IPN-ekre a CT-képeken. Ez a szérummetabolizmus-osztályozó jól teljesített a 6 mm-nél nagyobb csomók rosszindulatúságának előrejelzésében, 0,927 AUC-vel. Összefoglalva, eredményeink azt mutatják, hogy az egyedi szérum metabolomikus jellemzők specifikusan tükrözhetik a korai tumor által kiváltott metabolikus változásokat, és potenciális értékkel bírhatnak kockázatprediktorként, függetlenül a góc méretétől.
Figyelemre méltó, hogy a tüdő adenokarcinóma (LUAD) és a laphámsejtes karcinóma (LUSC) a nem kissejtes tüdőrák (NSCLC) fő típusai. Tekintettel arra, hogy a LUSC szorosan összefügg a dohányzással47, és a LUAD a CT-szűrésen véletlenszerűen észlelt tüdőcsomók leggyakoribb szövettani típusa48, osztályozó modellünket kifejezetten az I. stádiumú adenokarcinóma mintákhoz fejlesztettük ki. Wang és kollégái szintén a LUAD-ra összpontosítottak, és lipidomika segítségével kilenc lipidszignatúrát azonosítottak a korai stádiumú tüdőrák egészséges egyénektől való megkülönböztetésére17. A jelenlegi osztályozó modellt 16 I. stádiumú LUSC és 74 jóindulatú csomó esetén teszteltük, és alacsony LUSC-előrejelzési pontosságot (AUC 0,776) figyeltünk meg, ami arra utal, hogy a LUAD-nak és a LUSC-nek saját metabolomikus szignatúrái lehetnek. Valójában kimutatták, hogy a LUAD és a LUSC etiológiájában, biológiai eredetében és genetikai rendellenességeiben különbözik49. Ezért más típusú szövettani típusokat is be kell vonni a szűrőprogramokban a tüdőrák populációalapú kimutatására szolgáló tanulómodellekbe.
Jelen tanulmányban a tüdő adenokarcinómában a hat leggyakrabban megváltozott útvonalat azonosítottuk az egészséges kontrollokhoz és a jóindulatú göbökhöz képest. A xantin és a hipoxantin a purin anyagcsere-útvonal gyakori metabolitjai. Eredményeinkkel összhangban a purin-anyagcserével kapcsolatos intermedierek szintje szignifikánsan magasabb volt a tüdő adenokarcinómás betegek szérumában vagy szöveteiben az egészséges kontrollokhoz vagy az invazív beavatkozás előtti stádiumban lévő betegekhez képest15,50. A megemelkedett szérum xantin- és hipoxantinszint tükrözheti a gyorsan proliferáló rákos sejtek által megkövetelt anabolizmust. A glükóz-anyagcsere szabályozási zavara a rák anyagcseréjének jól ismert jellemzője51. Jelen tanulmányban a piruvát és a laktát szignifikáns növekedését figyeltük meg az LA csoportban a HC és BN csoporthoz képest, ami összhangban van a nem kissejtes tüdőrákos (NSCLC) betegek és az egészséges kontrollok szérum metabolomprofiljaiban a glikolízis útvonal rendellenességeiről szóló korábbi jelentésekkel. Az eredmények konzisztensek52,53.
Fontos kiemelni, hogy a tüdő adenokarcinómák szérumában inverz összefüggést figyeltünk meg a piruvát és a triptofán anyagcseréje között. A szérum triptofánszintje csökkent volt az LA csoportban a HC vagy BN csoporthoz képest. Érdekes módon egy korábbi, nagyszabású, prospektív kohorszvizsgálat kimutatta, hogy a keringő triptofán alacsony szintje összefüggésben állt a tüdőrák fokozott kockázatával54. A triptofán egy esszenciális aminosav, amelyet teljes egészében élelmiszerekből nyerünk. Arra a következtetésre jutottunk, hogy a szérum triptofánhiánya tüdő adenokarcinómában ennek a metabolitnak a gyors kimerülését tükrözheti. Köztudott, hogy a triptofán katabolizmusának végterméke a kinurenin útvonalon keresztül a de novo NAD+ szintézis forrása. Mivel a NAD+ elsősorban a mentési útvonalon keresztül termelődik, a NAD+ fontossága a triptofán anyagcserében az egészség és a betegség szempontjából még meghatározásra vár46. A TCGA adatbázis elemzése kimutatta, hogy a triptofán transzporter oldott transzporter 7A5 (SLC7A5) expressziója szignifikánsan megnövekedett a tüdő adenokarcinómában a normál kontrollokhoz képest, és pozitív korrelációt mutatott a GAPDH glikolítikus enzim expressziójával. Korábbi tanulmányok főként a triptofán-katabolizmus szerepére összpontosítottak a daganatellenes immunválasz elnyomásában40,41,42. Jelen tanulmányban bemutatjuk, hogy a triptofánfelvétel gátlása az SLC7A5 expressziójának csökkenése révén tüdőráksejtekben a sejtek NAD-szintjének ezt követő csökkenéséhez, és ezzel egyidejűleg a glikolítikus aktivitás gyengüléséhez vezet. Összefoglalva, tanulmányunk biológiai alapot szolgáltat a tüdő adenokarcinóma rosszindulatú transzformációjával összefüggő szérumanyagcsere-változásokra.
Az EGFR-mutációk a leggyakoribb hajtómutációk a nem kissejtes tüdőrákos (NSCLC) betegeknél. Tanulmányunkban azt találtuk, hogy az EGFR-mutációval rendelkező betegek (n = 41) összességében hasonló metabolomikai profillal rendelkeztek, mint a vad típusú EGFR-rel rendelkező betegek (n = 31), bár egyes EGFR-mutáns betegeknél csökkent szérumszintet találtunk az acilkarnitinnal kezelt betegeknél. Az acilkarnitinek megállapított funkciója az acilcsoportok citoplazmából a mitokondriális mátrixba történő szállítása, ami a zsírsavak oxidációjához vezet energiatermelés céljából55. Eredményeinkkel összhangban egy nemrégiben készült tanulmány 102 tüdőadenokarcinóma szövetminta globális metabolomjának elemzésével50 hasonló metabolomprofilokat azonosított az EGFR-mutáns és az EGFR-vad típusú tumorok között. Érdekes módon az EGFR-mutáns csoportban is találtak acilkarnitin-tartalmat. Ezért további vizsgálatokat érdemes lehet megvizsgálni, hogy az acilkarnitin szintjének változásai tükrözik-e az EGFR által kiváltott metabolikus változásokat és az alapul szolgáló molekuláris útvonalakat.
Összefoglalva, tanulmányunk létrehoz egy szérum metabolikus osztályozót a tüdőcsomók differenciáldiagnózisához, és egy olyan munkafolyamatot javasol, amely optimalizálhatja a kockázatértékelést és megkönnyítheti a CT-vizsgálaton alapuló klinikai ellátást.
Ezt a tanulmányt a Sun Yat-sen Egyetemi Rákkórház Etikai Bizottsága, a Sun Yat-sen Egyetem Első Kapcsolódó Kórháza és a Zhengzhoui Egyetemi Rákkórház Etikai Bizottsága hagyta jóvá. A felfedező és a belső validációs csoportokban 174 szérumot gyűjtöttek egészséges egyénektől és 244 szérumot jóindulatú csomóktól olyan egyénektől, akik éves orvosi vizsgálaton vettek részt a Sun Yat-sen Egyetemi Rákközpont Rákellenőrzési és Megelőzési Osztályán, valamint 166 jóindulatú csomót. I. stádiumú tüdő adenokarcinómákat gyűjtöttek a Sun Yat-sen Egyetemi Rákközpontból. A külső validációs csoportban 48 jóindulatú csomó, 39 I. stádiumú tüdő adenokarcinóma eset volt a Sun Yat-sen Egyetem Első Kapcsolódó Kórházából és 24 I. stádiumú tüdő adenokarcinóma eset a Zhengzhoui Rákkórházból. A Sun Yat-sen Egyetemi Rákközpont 16 I. stádiumú laphámsejtes tüdőrákos esetet is gyűjtött a bevált metabolikus osztályozó diagnosztikai képességének tesztelésére (a betegek jellemzőit az 5. kiegészítő táblázat mutatja). A felfedező kohorszból és a belső validációs kohorszból a mintákat 2018 januárja és 2020 májusa között gyűjtötték. A külső validációs kohorsz mintáit 2021 augusztusa és 2022 októbere között gyűjtötték. A nemi torzítás minimalizálása érdekében az egyes kohorszokhoz megközelítőleg azonos számú férfi és női esetet rendeltek. Felfedező Csoport és Belső Felülvizsgáló Csoport. A résztvevők nemét önbevallás alapján határozták meg. Minden résztvevőtől tájékozott beleegyezést szereztek be, és nem fizettek ellenszolgáltatást. A jóindulatú csomókkal rendelkező alanyok azok voltak, akik az elemzés időpontjában 2-5 év elteltével stabil CT-vizsgálati pontszámmal rendelkeztek, kivéve 1 esetet a külső validációs mintából, amelyet műtét előtt gyűjtöttek és hisztopatológiai vizsgálattal diagnosztizáltak. A krónikus hörghurut kivételével. A tüdő adenokarcinóma eseteit a tüdőreszekció előtt gyűjtötték, és patológiai diagnózissal igazolták. Az éhomi vérmintákat szérumszeparációs csövekbe gyűjtötték antikoagulánsok nélkül. A vérmintákat 1 órán át szobahőmérsékleten alvadtatták, majd 2851 × g-vel 10 percig 4°C-on centrifugálták a szérum felülúszó összegyűjtése érdekében. A szérum alikvotokat -80°C-on fagyasztották a metabolitok kivonásáig. A Sun Yat-sen Egyetem Rákközpontjának Rákmegelőzési és Orvosi Vizsgálati Osztálya 100 egészséges donortól gyűjtött össze szérumot, köztük azonos számú, 40 és 55 év közötti férfit és nőt. Az egyes donormintákból egyenlő térfogatú részeket kevertek össze, a kapott keveréket aliquotokra osztották és -80°C-on tárolták. A szérumkeveréket referenciaanyagként használták a minőségellenőrzéshez és az adatok standardizálásához.
A referencia szérumot és a tesztmintákat felolvasztották, és a metabolitokat kombinált extrakciós módszerrel (MTBE/metanol/víz) extrahálták. 56 Röviden, 50 μl szérumot 225 μl jéghideg metanollal és 750 μl jéghideg metil-terc-butil-éterrel (MTBE) kevertek össze. A keveréket keverés után 1 órán át jégen inkubálták. A mintákat ezután összekeverték, és vortexelték 188 μl belső standardokat (13C-laktát, 13C3-piruvát, 13C-metionin és 13C6-izoleucin, a Cambridge Isotope Laboratories-tól vásárolták) tartalmazó MS minőségű vízzel. Az elegyet ezután 15 000 × g-vel 10 percig 4 °C-on centrifugálták, majd az alsó fázist két csőbe (egyenként 125 μl) vitték át LC-MS analízishez pozitív és negatív módban. Végül a mintát nagy sebességű vákuumkoncentrátorban szárazra párolták.
A szárított metabolitokat 120 μl 80%-os acetonitrilben oldottuk fel, 5 percig vortexeltük, majd 15 000 × g-vel 10 percig 4°C-on centrifugáltuk. A felülúszókat mikrobetétekkel ellátott borostyánszínű üvegfiolákba vittük át metabolomikai vizsgálatokhoz. Célzatlan metabolomikai analízis ultrahangos folyadékkromatográfiás-nagy felbontású tömegspektrometriás (UPLC-HRMS) platformon. A metabolitokat Dionex Ultimate 3000 UPLC rendszerrel és ACQUITY BEH Amide oszloppal (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters) választottuk el. Pozitív ion módban a mozgó fázisok 95% (A) és 50% acetonitrilt (B) tartalmaztak, amelyek mindegyike 10 mmol/L ammónium-acetátot és 0,1% hangyasavat tartalmazott. Negatív módban az A és B mozgófázisok 95%, illetve 50% acetonitrilt tartalmaztak, mindkét fázis 10 mmol/L ammónium-acetátot tartalmazott, pH = 9. A gradiens program a következő volt: 0–0,5 perc, 2% B; 0,5–12 perc, 2–50% B; 12–14 perc, 50–98% B; 14–16 perc, 98% B; 16–16,1 perc, 98–2% B; 16,1–20 perc, 2% B. Az oszlopot 40°C-on, a mintát 10°C-on tartottuk az automata mintavevőben. Az áramlási sebesség 0,3 ml/perc, a befecskendezési térfogat 3 μl volt. Egy Q-Exactive Orbitrap tömegspektrométert (Thermo Fisher Scientific) elektrospray ionizációs (ESI) forrással teljes pásztázási módban működtettünk, és ddMS2 monitorozási móddal összekapcsoltuk nagy mennyiségű adat gyűjtése érdekében. Az MS paramétereket a következőképpen állítottuk be: porlasztási feszültség +3,8 kV/- 3,2 kV, kapilláris hőmérséklet 320 °C, védőgáz 40 arb, segédgáz 10 arb, szondafűtő hőmérséklete 350 °C, szkennelési tartomány 70–1050 m/h, felbontás 70 000. Az adatokat Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific) segítségével gyűjtöttük.
Az adatminőség értékeléséhez összegyűjtött minőségellenőrzési (QC) mintákat készítettek úgy, hogy minden mintából 10 μl-es felülúszót vettek ki. Az analitikai szekvencia elején hat minőségellenőrzési minta injekcióját elemezték az UPLC-MS rendszer stabilitásának felmérése érdekében. Ezután a minőségellenőrzési mintákat rendszeresen bejuttatták a tételbe. A vizsgálatban szereplő mind a 11 szérumminta-tételt LC-MS-sel elemezték. 100 egészséges donortól származó szérumkeverék alikvotjait használták referenciaanyagként az egyes tételekben az extrakciós folyamat monitorozására és a tételek közötti hatások korrigálására. A felfedező kohorsz, a belső validációs kohorsz és a külső validációs kohorsz nem célzott metabolomikai elemzését a Sun Yat-sen Egyetem Metabolomikai Központjában végezték. A Guangdong Műszaki Egyetem Elemző és Tesztelő Központjának külső laboratóriuma szintén 40 mintát elemzett a külső kohorszból az osztályozó modell teljesítményének tesztelésére.
Az extrakció és rekonstitúció után a szérum metabolitok abszolút mennyiségi meghatározását ultra-nagy teljesítményű folyadékkromatográfia-tandem tömegspektrometriával (Agilent 6495 triple quadrupole) mértük elektrospray ionizációs (ESI) forrással, többszörös reakciómonitorozási (MRM) módban. A metabolitok elválasztásához ACQUITY BEH Amide oszlopot (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters) használtunk. A mozgó fázis 90% (A) és 5% acetonitrilből (B) állt, 10 mmol/L ammónium-acetáttal és 0,1%-os ammóniaoldattal. A gradiens program a következő volt: 0–1,5 perc, 0% B; 1,5–6,5 perc, 0–15% B; 6,5–8 perc, 15% B; 8–8,5 perc, 15%–0% B; 8,5–11,5 perc, 0%B. Az oszlopot 40 °C-on, a mintát 10 °C-on tartottuk az automata mintavevőben. Az áramlási sebesség 0,3 ml/perc, a befecskendezési térfogat 1 μL volt. Az MS paramétereket a következőképpen állították be: kapilláris feszültség ±3,5 kV, porlasztónyomás 35 psi, védőgáz áramlása 12 l/perc, védőgáz hőmérséklete 350 °C, szárítógáz hőmérséklete 250 °C és szárítógáz áramlása 14 l/perc. A triptofán, piruvát, laktát, hipoxantin és xantin MRM konverziói 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 és 151,0–107,9 voltak. Az adatokat a Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies) szoftverrel gyűjtöttük. Szérumminták esetében a triptofán, piruvát, laktát, hipoxantin és xantin mennyiségét standard keverékoldatok kalibrációs görbéivel határoztuk meg. Sejtminták esetében a triptofán-tartalmat a belső standardhoz és a sejtfehérje-tömeghez normalizáltuk.
A csúcsextrakciót (m/z és retenciós idő (RT)) a Compound Discovery 3.1 és a TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific) szoftverekkel végeztük. A tételek közötti esetleges különbségek kiküszöbölése érdekében a tesztminta minden egyes jellemző csúcsát elosztottuk az ugyanazon tételből származó referenciaanyag jellemző csúcsával, hogy megkapjuk a relatív abundanciát. A belső standardok standardizálás előtti és utáni relatív szórását a 6. kiegészítő táblázat mutatja. A két csoport közötti különbségeket a téves felfedezési arány (FDR<0,05, Wilcoxon előjeles rangpróba) és a változás-szoros érték (>1,2 vagy <0,83) jellemezte. Az extrahált jellemzők nyers MS adatait és a referencia szérumra korrigált MS adatokat az 1. és a 2. kiegészítő adat mutatja. A csúcsok annotációját négy meghatározott azonosítási szint alapján végeztük, beleértve az azonosított metabolitokat, a feltételezetten annotált vegyületeket, a feltételezetten jellemzett vegyületosztályokat és az ismeretlen vegyületeket 22. A Compound Discovery 3.1-ben (mzCloud, HMDB, Chemspider) végzett adatbázis-keresések alapján végül azokat a biológiai vegyületeket választották ki, amelyek MS/MS pontszáma megfelelt a validált standardoknak, vagy amelyek pontos egyezést mutattak az mzCloudban vagy a Chemspiderben. Az egyes jellemzők csúcsértékei annotációként szerepelnek a 3. kiegészítő adatban. A MetaboAnalyst 5.0-t használták az összeg-normalizált metabolitbőség egyváltozós elemzéséhez. A MetaboAnalyst 5.0 a KEGG útvonal dúsulási elemzését is értékelte a szignifikánsan eltérő metabolitok alapján. A főkomponens-analízist (PCA) és a részleges legkisebb négyzetek diszkrimináns analízisét (PLS-DA) a ropls szoftvercsomaggal (v.1.26.4) elemezték veremnormalizálással és autoskálázással. A csomók malignitásának előrejelzésére optimális metabolit biomarker modellt bináris logisztikus regresszióval, legkisebb abszolút zsugorítással és szelekciós operátorral (LASSO, R csomag v.4.1-3) generálták. A diszkrimináns modell teljesítményét a detektálási és validálási halmazokban a pROC csomag (v.1.18.0.) szerinti ROC-analízis alapján becsült AUC-vel jellemeztük. Az optimális valószínűségi határértéket a modell maximális Youden-indexe (érzékenység + specificitás – 1) alapján kaptuk meg. A küszöbértéknél kisebb vagy nagyobb értékekkel rendelkező mintákat jóindulatú csomóként, illetve tüdőadenokarcinómaként jósoltuk.
Az A549 sejteket (#CCL-185, American Type Culture Collection) 10% FBS-t tartalmazó F-12K táptalajon tenyésztettük. Az SLC7A5-öt célzó rövid hajtű RNS (shRNS) szekvenciákat és egy nem célzó kontrollt (NC) inszertáltunk a pLKO.1-puro lentivirális vektorba. Az shSLC7A5 antiszensz szekvenciái a következők: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). Az SLC7A5 (#5347) és a tubulin (#2148) elleni antitesteket a Cell Signaling Technology-tól vásároltuk. Az SLC7A5 és a tubulin elleni antitesteket 1:1000 hígításban használtuk Western blot analízishez.
A Seahorse XF glikolitikus stresszteszt az extracelluláris savasodás (ECAR) szintjét méri. A vizsgálat során glükózt, oligomicin A-t és 2-DG-t adagoltak egymás után a sejtek glikolítikus kapacitásának ECAR-ral mért tesztelésére.
A nem célzott kontrollal (NC) és shSLC7A5-tel (Sh1, Sh2) transzfektált A549 sejteket egy éjszakán át 10 cm átmérőjű csészékbe szélesztettük. A sejtmetabolitokat 1 ml jéghideg 80%-os vizes metanollal extraháltuk. A metanolos oldatban lévő sejteket lekapartuk, új csőbe gyűjtöttük, majd 15 000 × g-vel 15 percig 4°C-on centrifugáltuk. 800 µl felülúszót gyűjtöttünk, és nagy sebességű vákuumkoncentrátorral szárítottuk. A szárított metabolitpelleteket ezután LC-MS/MS segítségével elemeztük triptofánszintre a fent leírtak szerint. Az A549 sejtek (NC és shSLC7A5) sejtes NAD(H) szintjét kvantitatív NAD+/NADH kolorimetriás készlettel (#K337, BioVision) mértük a gyártó utasításai szerint. Minden mintában fehérjeszintet mértünk a metabolitok mennyiségének normalizálása érdekében.
A minta méretének előzetes meghatározásához nem alkalmaztunk statisztikai módszereket. A biomarkerek felfedezésére irányuló korábbi metabolomikai vizsgálatokat15,18 tekintették a méretmeghatározás referenciaértékeinek, és ezekkel a jelentésekkel összehasonlítva a mi mintánk megfelelő volt. A vizsgálati kohorszból nem zártunk ki mintákat. A szérummintákat véletlenszerűen egy felfedező csoportba (306 eset, 74,6%) és egy belső validációs csoportba (104 eset, 25,4%) soroltuk a nem célzott metabolomikai vizsgálatokhoz. A célzott metabolomikai vizsgálatokhoz a felfedező csoport mindkét csoportjából véletlenszerűen 70 esetet választottunk ki. A kutatók az LC-MS adatgyűjtés és -elemzés során nem tudták, hogy melyik csoportba sorolják őket. A metabolomikai adatok és a sejtkísérletek statisztikai elemzését az Eredmények, az Ábrák jelmagyarázata és a Módszerek szakaszok ismertetik. A sejtes triptofán, az NADT és a glikolítikus aktivitás mennyiségi meghatározását háromszor, egymástól függetlenül végeztük, azonos eredményekkel.
A tanulmány felépítésével kapcsolatos további információkért lásd a cikkhez kapcsolódó Natural Portfolio Report Abstract-ot.
A kivont jellemzők nyers MS adatait és a referencia szérum normalizált MS adatait az 1. és 2. kiegészítő adatok mutatják. A differenciális jellemzők csúcsérték-annotációi a 3. kiegészítő adatokban találhatók. Az LUAD TCGA adatkészlet letölthető a https://portal.gdc.cancer.gov/ címről. A grafikon ábrázolásához szükséges bemeneti adatokat a forrásadatok tartalmazzák. A forrásadatokat ehhez a cikkhez adtuk meg.
Nemzeti Tüdőszűrő Tanulmányi Csoport stb. A tüdőrák okozta halálozás csökkentése alacsony dózisú komputertomográfiával. Észak-Anglia. J. Med. 365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR és Prophet, PC Tüdőrákszűrés alacsony dózisú helikális CT-vel: az Országos Tüdőszűrési Tanulmány (NLST) eredményei. J. Med. Screen 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ és munkatársai. A tüdőrák okozta halálozás csökkentése volumetrikus CT-szűréssel egy randomizált vizsgálatban. Észak-Anglia. J. Med. 382, 503–513 (2020).
Közzététel ideje: 2023. szeptember 18.