A komputertomográfiával (CT) azonosított pulmonalis csomók differenciáldiagnózisa továbbra is kihívást jelent a klinikai gyakorlatban.Itt 480 szérumminta globális metabolizmusát jellemezzük, beleértve az egészséges kontrollokat, a jóindulatú tüdőcsomókat és az I. stádiumú tüdő adenokarcinómát.Az adenokarcinómák egyedi metabolomikus profilokat mutatnak, míg a jóindulatú csomók és az egészséges egyének metabolomikus profiljai nagy hasonlóságot mutatnak.A felfedező csoportban (n = 306) 27 metabolitot azonosítottak, amelyek megkülönböztetik a jóindulatú és rosszindulatú csomókat.A diszkrimináns modell AUC értéke a belső (n = 104) és a külső validálási (n = 111) csoportban 0,915 és 0,945 volt.Az útvonal-analízis kimutatta, hogy a tüdő adenokarcinóma szérumában a triptofán csökkenése miatt megnövekedett a glikolitikus metabolitok mennyisége a jóindulatú csomókhoz és az egészséges kontrollokhoz képest, és azt sugallta, hogy a triptofán felvétel elősegíti a glikolízist a tüdőráksejtekben.Tanulmányunk kiemeli a szérum metabolit biomarkerek értékét a CT-vel kimutatott tüdőcsomók kockázatának felmérésében.
A korai diagnózis elengedhetetlen a rákos betegek túlélési arányának javításához.Az Egyesült Államok Nemzeti Tüdőrákszűrési Vizsgálatának (NLST) és az európai NELSON-tanulmánynak az eredményei kimutatták, hogy az alacsony dózisú komputertomográfiával (LDCT) végzett szűrés jelentősen csökkentheti a tüdőrák mortalitását a magas kockázatú csoportokban1,2,3.Az LDCT tüdőrákszűrésben való széles körű alkalmazása óta a tünetmentes tüdőcsomók véletlenszerű radiográfiai leletei tovább nőttek 4 .A tüdőcsomók definíciója szerint legfeljebb 3 cm átmérőjű fokális homályok 5 .Nehézségekbe ütközünk a rosszindulatú daganatok valószínűségének felmérésében és az LDCT-n véletlenül észlelt nagyszámú tüdőcsomó kezelésében.A CT korlátai gyakori nyomon követési vizsgálatokhoz és hamis pozitív eredményekhez vezethetnek, ami szükségtelen beavatkozáshoz és túlkezeléshez vezethet6.Ezért megbízható és hasznos biomarkerek kifejlesztésére van szükség a tüdőrák korai stádiumban történő helyes azonosításához és a legtöbb jóindulatú csomó megkülönböztetéséhez a kezdeti felismeréskor 7 .
A vér (szérum, plazma, perifériás vér mononukleáris sejtjeinek) átfogó molekuláris elemzése, beleértve a genomikát, a proteomikát vagy a DNS-metilációt8, 9, 10, egyre nagyobb érdeklődést váltott ki a tüdőrák diagnosztikai biomarkereinek felfedezése iránt.Eközben a metabolomikai megközelítések olyan sejtes végtermékeket mérnek, amelyeket endogén és exogén hatások befolyásolnak, és ezért a betegség kialakulásának és kimenetelének előrejelzésére alkalmazzák.A folyadékkromatográfiás-tandem tömegspektrometria (LC-MS) nagy érzékenysége és nagy dinamikus tartománya miatt széles körben alkalmazott módszer a metabolomikai vizsgálatokban, amely különböző fizikai-kémiai tulajdonságokkal rendelkező metabolitokat képes lefedni11,12,13.Bár a plazma/szérum globális metabolomikai analízisét használták a tüdőrák diagnózisával14, 15, 16, 17 és a kezelés hatékonyságával kapcsolatos biomarkerek azonosítására, a szérum metabolitok osztályozói a jóindulatú és rosszindulatú tüdőcsomók megkülönböztetésére még sokat kell tanulmányozni.- hatalmas kutatás.
Az adenokarcinóma és a laphámsejtes karcinóma a nem-kissejtes tüdőrák (NSCLC) két fő altípusa.Különféle CT szűrővizsgálatok azt mutatják, hogy az adenokarcinóma a tüdőrák leggyakoribb szövettani típusa1,19,20,21.Ebben a vizsgálatban ultra-teljesítményű folyadékkromatográfiás-nagyfelbontású tömegspektrometriát (UPLC-HRMS) használtunk, hogy metabolomikai elemzést végezzünk összesen 695 szérummintán, beleértve az egészséges kontrollokat, a jóindulatú tüdőcsomókat és a CT-vel kimutatott ≤3 cm-t.stádiumú tüdő adenokarcinóma szűrése.A szérum metabolitokból álló panelt azonosítottuk, amely megkülönbözteti a tüdő adenokarcinómát a jóindulatú csomóktól és az egészséges kontrolloktól.Az útvonal-dúsítási elemzés kimutatta, hogy a kóros triptofán- és glükóz-anyagcsere gyakori eltérések a tüdő adenokarcinómában, összehasonlítva a jóindulatú csomókkal és az egészséges kontrollokkal.Végül létrehoztunk és validáltunk egy nagy specificitású és érzékenységű szérum metabolikus osztályozót az LDCT által kimutatott rosszindulatú és jóindulatú tüdőcsomók megkülönböztetésére, amely segíthet a korai differenciáldiagnózisban és a kockázatértékelésben.
A jelenlegi vizsgálatban a nemnek és életkornak megfelelő szérummintákat retrospektív módon gyűjtöttek 174 egészséges kontrollcsoporttól, 292 jóindulatú tüdőcsomókban szenvedő betegtől és 229 I. stádiumú tüdőadenokarcinómában szenvedő betegtől.A 695 alany demográfiai jellemzőit az 1. kiegészítő táblázat tartalmazza.
Amint az 1a. ábrán látható, összesen 480 szérummintát, köztük 174 egészséges kontrollt (HC), 170 jóindulatú csomót (BN) és 136 I. stádiumú tüdőadenokarcinóma (LA) mintát gyűjtöttek a Sun Yat-sen Egyetem Rákkutató Központjában.Felfedezési kohorsz a nem célzott metabolomikus profilalkotáshoz ultra-teljesítményű folyadékkromatográfiás-nagyfelbontású tömegspektrometriával (UPLC-HRMS).Amint az 1. kiegészítő ábrán látható, az LA és a HC, az LA és a BN közötti differenciált metabolitokat azonosították az osztályozási modell felállítása és a differenciálút-elemzés további feltárása érdekében.A Szun Jat-szen Egyetem Rákkutató Központja által gyűjtött 104 mintát és két másik kórház 111 mintáját külső, illetve belső validálásnak vetették alá.
egy tanulmányi populáció a felfedezőcsoportban, amelyen ultra-teljesítményű folyadékkromatográfiás-nagyfelbontású tömegspektrometriával (UPLC-HRMS) végzett globális szérum metabolomikai elemzést végeztek.b A vizsgálati kohorszból származó 480 szérumminta teljes metabolomjának részleges legkisebb négyzetes diszkriminancia analízise (PLS-DA), beleértve az egészséges kontrollokat (HC, n = 174), a jóindulatú csomókat (BN, n = 170) és az I. stádiumú tüdő adenokarcinómát (Los Angeles, n = 136).+ESI, pozitív elektrospray ionizációs mód, -ESI, negatív elektrospray ionizációs mód.c–e A két adott csoportban szignifikánsan eltérő abundanciájú metabolitokat (kétfarkú Wilcoxon előjelű rangteszt, hamis felfedezési rátával korrigált p-érték, FDR <0,05) piros (szoros változás > 1,2) és kék (szoros változás < 0,83) színnel tüntettük fel. .) látható a vulkán ábráján.f Hierarchikus klaszterező hőtérkép, amely jelentős különbségeket mutat az annotált metabolitok számában LA és BN között.A forrásadatok forrásadatfájlok formájában állnak rendelkezésre.
A 174 HC, 170 BN és 136 LA teljes szérum metabolomját a felfedezett csoportban UPLC-HRMS analízissel elemeztük.Először megmutatjuk, hogy a minőség-ellenőrzési (QC) minták szorosan egy felügyelt főkomponens-analízis (PCA) modell középpontjában helyezkednek el, megerősítve a jelenlegi vizsgálat teljesítményének stabilitását (2. kiegészítő ábra).
Amint az 1b. ábrán a részleges legkisebb négyzetek diszkriminancia analízise (PLS-DA) mutatja, azt találtuk, hogy egyértelmű különbségek vannak az LA és a BN, az LA és a HC között pozitív (+ESI) és negatív (-ESI) elektrospray ionizációs módokban. .izolált.Nem találtunk azonban szignifikáns különbséget a BN és a HC között +ESI és -ESI körülmények között.
Az LA és a HC között 382, az LA és a BN között 231, a BN és a HC között pedig 95 különbségi jellemzőt találtunk (Wilcoxon előjeles rangteszt, FDR <0,05 és többszörös változás >1,2 vagy <0,83) (.1c-e ábra) )..A csúcsokat tovább annotáltuk (3. kiegészítő adat) egy adatbázishoz (mzCloud/HMDB/Chemspider könyvtár) m/z értékkel, retenciós idővel és fragmentációs tömegspektrum-kereséssel (a részleteket a Módszerek részben ismertetjük) 22 .Végül 33 és 38 annotált metabolitot azonosítottak, amelyek abundanciájában jelentős különbségek mutatkoztak az LA és a BN (1f ábra és 2. kiegészítő táblázat), valamint az LA és a HC (2. kiegészítő ábra) és a 2. kiegészítő táblázat esetében.Ezzel szemben a BN-ben és a HC-ban csak 3 metabolitot azonosítottak, amelyek bőségében jelentős különbségek voltak (2. kiegészítő táblázat), ami összhangban van a BN és a HC közötti átfedéssel a PLS-DA-ban.Ezek a különböző metabolitok a biokémiai anyagok széles skáláját fedik le (4. kiegészítő ábra).Összességében ezek az eredmények jelentős változásokat mutatnak a szérum metabolomában, amelyek a korai stádiumú tüdőrák rosszindulatú átalakulását tükrözik a jóindulatú tüdőcsomókhoz vagy az egészséges alanyokhoz képest.Eközben a BN és a HC szérum metabolomjának hasonlósága azt sugallja, hogy a jóindulatú tüdőcsomók számos biológiai jellemzővel rendelkezhetnek egészséges egyének esetében.Tekintettel arra, hogy az epidermális növekedési faktor receptor (EGFR) génmutációi gyakoriak a tüdő adenokarcinóma 23-as altípusában, megpróbáltuk meghatározni a driver mutációk hatását a szérum metabolomára.Ezután 72 EGFR-státusú eset teljes metabolomikus profilját elemeztük a tüdő adenokarcinóma csoportban.Érdekes módon összehasonlítható profilokat találtunk az EGFR mutáns betegek (n = 41) és az EGFR vad típusú betegek (n = 31) között a PCA elemzés során (kiegészítő 5a ábra).Mindazonáltal 7 metabolitot azonosítottunk, amelyek mennyisége szignifikánsan megváltozott az EGFR-mutációban szenvedő betegekben a vad típusú EGFR-ben szenvedő betegekhez képest (t-teszt, p < 0,05 és szoros változás > 1,2 vagy < 0,83) (kiegészítő 5b ábra).Ezen metabolitok többsége (7-ből 5) acilkarnitinek, amelyek fontos szerepet játszanak a zsírsav-oxidációs folyamatokban.
Amint azt a 2a. ábrán bemutatott munkafolyamat szemlélteti, a csomók osztályozására szolgáló biomarkereket a legkisebb abszolút zsugorodási operátorok és 33, LA-ban (n = 136) és BN-ben (n = 170) azonosított metaboliton alapuló szelekcióval kaptuk meg.A változók legjobb kombinációja (LASSO) – bináris logisztikus regressziós modell.A modell megbízhatóságának tesztelésére tízszeres keresztvalidációt alkalmaztunk.A változók kiválasztását és a paraméterek szabályozását a λ24 paraméterű valószínűség maximalizálási büntetés korrigálja.A globális metabolomikai elemzést a továbbiakban egymástól függetlenül végezték el a belső validálási (n = 104) és a külső validációs (n = 111) csoportban, hogy teszteljék a diszkrimináns modell osztályozási teljesítményét.Ennek eredményeként a felfedezési halmazban 27 metabolitot azonosítottak a legjobb diszkrimináns modellként a legnagyobb átlagos AUC értékkel (2b. ábra), amelyek közül 9 aktivitása megnövekedett és 18 csökkent aktivitású LA-ban a BN-hez képest (2c. ábra).
Munkafolyamat tüdőcsomók osztályozó felépítéséhez, ideértve a szérum metabolitok legjobb paneljének kiválasztását a felfedezési készletben egy bináris logisztikus regressziós modell segítségével tízszeres keresztellenőrzéssel, valamint a prediktív teljesítmény értékelését a belső és külső validációs készletekben.b A LASSO regressziós modell kereszt-validációs statisztikái a metabolikus biomarker kiválasztásához.A fent megadott számok az adott λ-nál kiválasztott biomarkerek átlagos számát jelentik.A piros pontozott vonal az átlagos AUC értéket jelenti a megfelelő lambdánál.A szürke hibasávok a minimális és maximális AUC értékeket jelzik.A szaggatott vonal jelzi a legjobb modellt a 27 kiválasztott biomarkerrel.AUC, a vevő működési jellemzői (ROC) görbe alatti terület.c 27 kiválasztott metabolit változása az LA-csoportban a BN-csoporttal összehasonlítva a felfedezési csoportban.Piros oszlop – aktiválás.A kék oszlop csökkenést jelent.d–f Vevő működési jellemzői (ROC) görbék, amelyek a diszkrimináns modell erejét mutatják a felfedezési, belső és külső validációs készletekben található 27 metabolit kombináción alapuló megkülönböztető modell erejét.A forrásadatok forrásadatfájlok formájában állnak rendelkezésre.
E 27 metabolit súlyozott regressziós együtthatói alapján egy előrejelzési modellt hoztak létre (3. kiegészítő táblázat).A 27 metaboliton alapuló ROC analízis a görbe alatti terület (AUC) értéke 0,933, a felfedezési csoport érzékenysége 0,868, a specificitás pedig 0,859 (2d. ábra).Eközben az LA és a HC között 38 megjegyzéssel ellátott metabolit között egy 16 metabolitból álló sorozat 0,902 AUC-t ért el 0,801 érzékenységgel és 0,856 specificitással az LA megkülönböztetésében a HC-től (kiegészítő 6a-c ábra).A különböző metabolitok különböző szorzós változási küszöbértékein alapuló AUC-értékeket is összehasonlították.Azt találtuk, hogy az osztályozási modell akkor teljesített a legjobban az LA és a BN (HC) megkülönböztetésében, ha a hajtásváltozási szint 1,2-re volt beállítva 1,5-re vagy 2,0-ra (7a, b kiegészítő ábra).A 27 metabolitcsoporton alapuló osztályozási modellt belső és külső kohorszokban tovább validálták.Az AUC 0,915 (érzékenység 0,867, specificitás 0,811) volt a belső validálásnál és 0,945 (érzékenység 0,810, specificitás 0,979) a külső validálásnál (2e, f ábra).A laboratóriumok közötti hatékonyság felmérése érdekében a külső kohorszból 40 mintát elemeztek egy külső laboratóriumban a Módszerek részben leírtak szerint.Az osztályozási pontosság 0,925 AUC-t ért el (8. kiegészítő ábra).Mivel a tüdő laphámsejtes karcinóma (LUSC) a nem-kissejtes tüdőrák (NSCLC) második leggyakoribb altípusa a tüdő adenokarcinóma (LUAD) után, teszteltük a metabolikus profilok validált lehetséges hasznosságát is.BN és 16 LUSC eset.A LUSC és a BN közötti megkülönböztetés AUC értéke 0,776 volt (9. kiegészítő ábra), ami gyengébb képességet jelez a LUAD és BN közötti megkülönböztetéshez képest.
Tanulmányok kimutatták, hogy a csomók mérete a CT-felvételeken pozitívan korrelál a rosszindulatú daganatok kialakulásának valószínűségével, és továbbra is a csomók kezelésének fő meghatározója25, 26, 27.A NELSON szűrővizsgálat nagy csoportjának adatainak elemzése azt mutatta, hogy az 5 mm-nél kisebb csomópontokkal rendelkező alanyoknál a rosszindulatú daganatok kockázata még hasonló volt a csomópontok nélküli alanyokéhoz 28 .Ezért a rendszeres CT-monitorozást igénylő minimális méret a British Thoracic Society (BTS) ajánlása szerint 5 mm, a Fleischner Társaság ajánlása szerint pedig 6 mm29.Mindazonáltal a 6 mm-nél nagyobb és nyilvánvaló jóindulatú vonásokkal nem rendelkező csomók, az úgynevezett határozatlan tüdőcsomók (IPN), továbbra is komoly kihívást jelentenek a klinikai gyakorlat értékelésében és kezelésében30,31.Ezt követően megvizsgáltuk, hogy a csomók mérete befolyásolta-e a metabolomikus aláírásokat a felfedezési és belső validációs kohorszokból származó egyesített minták segítségével.27 validált biomarkerre összpontosítva először összehasonlítottuk a HC és BN 6 mm alatti metabolomok PCA profilját.Azt találtuk, hogy a HC és a BN adatpontjainak többsége átfedésben volt, ami azt mutatja, hogy a szérum metabolit szintje hasonló volt mindkét csoportban (3a. ábra).A különböző mérettartományok jellemző térképei megmaradtak BN-ben és LA-ban (3b. ábra, c), míg a rosszindulatú és jóindulatú csomók elkülönülését figyelték meg a 6–20 mm-es tartományban (3d. ábra).Ennek a kohorsznak az AUC értéke 0,927, a specificitása 0,868, az érzékenysége pedig 0,820 a 6-20 mm-es csomók rosszindulatúságának előrejelzéséhez (3e., f. ábra).Eredményeink azt mutatják, hogy az osztályozó képes rögzíteni a korai rosszindulatú átalakulás okozta metabolikus változásokat, függetlenül a csomó méretétől.
ad A PCA profilok összehasonlítása meghatározott csoportok között egy 27 metabolitból álló metabolikus osztályozó alapján.CC és BN < 6 mm.b BN < 6 mm vs BN 6–20 mm.LA-ban 6-20 mm szemben LA 20-30 mm-rel.g BN 6-20 mm és LA 6-20 mm.GC, n=174;BN < 6 mm, n = 153;BN 6–20 mm, n = 91;LA 6–20 mm, n = 89;LA 20–30 mm, n = 77. e Vevő működési karakterisztika (ROC) görbe, amely a diszkriminatív modell teljesítményét mutatja 6–20 mm-es csomókra.f A valószínűségi értékeket a logisztikus regressziós modell alapján számítottuk ki 6-20 mm-es csomókra.A szürke szaggatott vonal az optimális határértéket (0,455) jelzi.A fenti számok a Los Angelesre tervezett esetek százalékos arányát jelentik.Használjon kétoldali Student-féle t-tesztet.PCA, főkomponens elemzés.AUC terület a görbe alatt.A forrásadatok forrásadatfájlok formájában állnak rendelkezésre.
Négy (44–61 éves) hasonló tüdőcsomó-méretű (7–9 mm) mintát választottunk ki a javasolt malignitás-előrejelzési modell teljesítményének illusztrálására (4a, b ábra).A kezdeti szűrés során az 1. eset szilárd csomóként mutatkozott be meszesedéssel, amely jóindulatú tulajdonsággal társul, míg a 2. eset meghatározatlan, részben szilárd csomóként, nyilvánvaló jóindulatú jellemzők nélkül.A három követési CT-vizsgálat azt mutatta, hogy ezek az esetek 4 éven keresztül stabilak maradtak, és ezért jóindulatú csomóknak minősültek (4a. ábra).A sorozatos CT-vizsgálatok klinikai értékelésével összehasonlítva a jelenlegi osztályozó modellel végzett egyszeri szérum metabolit elemzés gyorsan és helyesen azonosította ezeket a jóindulatú csomókat a valószínűségi korlátok alapján (1. táblázat).A 3. esetben a 4b. ábra a mellhártya visszahúzódásának jeleit mutató csomót mutat be, amely leggyakrabban rosszindulatú daganathoz kapcsolódik32.A 4. eset egy meghatározatlan, részben szilárd csomóként mutatkozott be, jóindulatú ok nélkül.Ezeket az eseteket az osztályozó modell szerint rosszindulatúnak jósoltuk (1. táblázat).A tüdő adenokarcinóma megítélését tüdőreszekciós műtét utáni kórszövettani vizsgálat igazolta (4b. ábra).A külső validációs készlet esetében a metabolikus osztályozó pontosan megjósolta a 6 mm-nél nagyobb, határozatlan tüdőcsomók két esetét (10. kiegészítő ábra).
Két jóindulatú csomós esetnél a tüdő axiális ablakának CT-képei.Az 1. esetben a CT vizsgálat 4 év után stabil, 7 mm-es tömör csomót mutatott, meszesedéssel a jobb alsó lebenyben.A 2. esetben a CT vizsgálat 5 év után stabil, részben szilárd, 7 mm átmérőjű csomót mutatott ki a jobb felső lebenyben.b Axiális ablakos CT felvételek a tüdőről és a megfelelő patológiai vizsgálatok az I. stádiumú adenocarcinoma két esetéről tüdőreszekció előtt.A 3. eset 8 mm átmérőjű csomót tárt fel a jobb felső lebenyben pleurális visszahúzódással.A 4. eset a bal felső lebenyben egy 9 mm-es, részben tömör csiszolt üvegcsomót tárt fel.A kimetszett tüdőszövet hematoxilin és eozin (H&E) festése (skála = 50 μm), amely bemutatja a tüdő adenokarcinóma acináris növekedési mintáját.A nyilak jelzik a CT-képeken észlelt csomókat.A H&E képek a patológus által megvizsgált több (>3) mikroszkopikus mező reprezentatív képei.
Összességében eredményeink azt mutatják, hogy a szérum metabolit biomarkerek potenciális értéket képviselnek a pulmonalis csomók differenciáldiagnózisában, ami kihívásokat jelenthet a CT-szűrés értékelésekor.
Validált differenciális metabolit panel alapján igyekeztünk azonosítani a főbb metabolikus változások biológiai korrelációit.A MetaboAnalyst által végzett KEGG útvonal dúsítási analízise 6 közös szignifikánsan megváltozott útvonalat azonosított a két adott csoport között (LA vs. HC és LA vs. BN, korrigált p ≤ 0,001, hatás > 0,01).Ezeket a változásokat a piruvát-, triptofán-, niacin- és nikotinamid-metabolizmus, glikolízis, TCA-ciklus és purin-anyagcsere zavarai jellemezték (5a. ábra).Ezután célzott metabolomikát végeztünk, hogy abszolút kvantifikáció segítségével ellenőrizzük a főbb változásokat.Gyakori metabolitok meghatározása gyakran megváltozott útvonalakban tripla kvadrupól tömegspektrometriával (QQQ) autentikus metabolit standardok alkalmazásával.A metabolomikai vizsgálat célmintájának demográfiai jellemzőit a 4. kiegészítő táblázat tartalmazza. Globális metabolomikai eredményeinkkel összhangban a kvantitatív elemzés megerősítette, hogy a hipoxantin és a xantin, a piruvát és a laktát szintje nőtt LA-ban a BN-hez és a HC-hoz képest (5b, c ábra, p <0,05).Ezekben a metabolitokban azonban nem találtak szignifikáns különbséget a BN és a HC között.
Szignifikánsan eltérő metabolitok KEGG-útvonal-dúsítási analízise az LA csoportban a BN és HC csoportokhoz képest.Kétirányú Globaltesztet használtunk, és a p értékeket a Holm-Bonferroni módszerrel állítottuk be (beállított p ≤ 0,001 és hatásméret > 0,01).b–d Hegedűdiagramok, amelyek hipoxantin-, xantin-, laktát-, piruvát- és triptofánszintet mutatnak a szérum HC-, BN- és LA-szintjeiben LC-MS/MS-sel meghatározva (n = 70 csoportonként).A fehér és fekete szaggatott vonal jelzi a mediánt, illetve a kvartilist.e Violin diagram, amely az SLC7A5 és QPRT normalizált Log2TPM (transzkriptum per millió) mRNS-expresszióját mutatja tüdő adenokarcinómában (n = 513) a normál tüdőszövethez (n = 59) képest a LUAD-TCGA adatkészletben.A fehér doboz az interkvartilis tartományt, a vízszintes fekete vonal a közepén a mediánt, a függőleges fekete vonal pedig a négyzetből kinyúló 95%-os konfidencia intervallumot (CI) jelöli.f Az SLC7A5 és a GAPDH expressziójának Pearson korrelációs diagramja tüdő adenokarcinómában (n = 513) és normál tüdőszövetben (n = 59) a TCGA adatkészletben.A szürke terület a 95%-os CI-t jelenti.r, Pearson korrelációs együttható.g Normalizált celluláris triptofánszint a nem specifikus shRNS kontrollal (NC) és shSLC7A5-tel (Sh1, Sh2) transzfektált A549 sejtekben LC-MS/MS módszerrel meghatározva.Minden csoportban öt biológiailag független minta statisztikai elemzését mutatjuk be.h A NADt sejtszintje (teljes NAD, beleértve a NAD+-t és NADH-t is) az A549 sejtekben (NC) és az SLC7A5 leütött A549 sejtekben (Sh1, Sh2).Mindegyik csoportban három biológiailag független minta statisztikai elemzését mutatjuk be.i Az A549 sejtek glikolitikus aktivitását az SLC7A5 knockdown előtt és után az extracelluláris savasodási rátával (ECAR) mértük (n = 4 biológiailag független minta csoportonként).2-DG,2-dezoxi-D-glükóz.Kétfarkú Student-féle t-tesztet alkalmaztunk (b–h).A (g–i) hibasávok az átlagot ± SD-t jelentik, minden kísérletet háromszor végeztünk el egymástól függetlenül, és az eredmények hasonlóak voltak.A forrásadatok forrásadatfájlok formájában állnak rendelkezésre.
Figyelembe véve a megváltozott triptofán-metabolizmus jelentős hatását az LA csoportban, a HC, BN és LA csoportok szérum triptofánszintjét is értékeltük QQQ segítségével.Azt találtuk, hogy a szérum triptofán csökkent LA-ban a HC-hoz vagy BN-hez képest (p < 0,001, 5d. ábra), ami összhangban van a korábbi eredményekkel, miszerint a keringő triptofán szintje alacsonyabb a tüdőrákos betegekben, mint a kontrollcsoport egészséges kontrolljaiban33,34 ,35.Egy másik, PET/CT nyomjelzőt, 11C-metil-L-triptofánt használó vizsgálat azt találta, hogy a triptofán jelretenciós ideje a tüdőrákszövetben jelentősen megnőtt a jóindulatú elváltozásokhoz vagy a normál szövetekhez képest36.Feltételezzük, hogy a triptofán csökkenése az LA szérumban a tüdőráksejtek aktív triptofánfelvételét tükrözheti.
Az is ismert, hogy a triptofán-katabolizmus kinurenin útjának végterméke a NAD+37,38, amely fontos szubsztrát a glicerinaldehid-3-foszfát és 1,3-biszfoszfoglicerát reakciójában a glikolízisben39.Míg a korábbi tanulmányok a triptofán katabolizmusának az immunszabályozásban betöltött szerepére összpontosítottak, a jelenlegi tanulmányban a triptofán diszreguláció és a glikolitikus utak közötti kölcsönhatást próbáltuk tisztázni.Az oldott anyag transzporter család 7 tagja 5 (SLC7A5) ismert, hogy egy triptofán transzporter43,44,45.A kinolinsav-foszforibozil-transzferáz (QPRT) egy enzim, amely a kinurenin-útvonal lefelé található, és amely a kinolinsavat NAMN46-dá alakítja.A LUAD TCGA adatkészlet vizsgálata azt mutatta, hogy mind az SLC7A5, mind a QPRT szignifikánsan felülszabályozott a tumorszövetben a normál szövetekhez képest (5e. ábra).Ezt a növekedést a tüdő adenokarcinóma I. és II., valamint III. és IV. stádiumában figyelték meg (kiegészítő 11. ábra), ami a triptofán-metabolizmus korai, tumorigenezissel összefüggő zavarait jelzi.
Ezenkívül a LUAD-TCGA adatkészlet pozitív korrelációt mutatott az SLC7A5 és a GAPDH mRNS expressziója között rákos betegek mintáiban (r = 0,45, p = 1,55E-26, 5f ábra).Ezzel szemben nem találtunk szignifikáns korrelációt az ilyen génaláírások között normál tüdőszövetben (r = 0,25, p = 0,06, 5f ábra).Az SLC7A5 leütése (kiegészítő 12. ábra) A549 sejtekben jelentősen csökkentette a celluláris triptofán és NAD(H) szintet (5g,h ábra), ami az extracelluláris savasodási rátával (ECAR) mérve gyengített glikolitikus aktivitást eredményezett (1. ábra).5i).Így a szérum metabolikus változásai és az in vitro kimutatás alapján azt feltételezzük, hogy a triptofán metabolizmusa NAD+-t termelhet a kinurenin útvonalon keresztül, és fontos szerepet játszik a glikolízis elősegítésében tüdőrákban.
Tanulmányok kimutatták, hogy az LDCT által kimutatott nagyszámú határozatlan tüdőcsomó további vizsgálatok, például PET-CT, tüdőbiopszia és túlkezelés szükségességét eredményezheti a rosszindulatú daganat álpozitív diagnózisa miatt.31 Ahogy a 6. ábrán látható, tanulmányunk azonosította a szérum metabolitok potenciális diagnosztikai értékkel rendelkező paneljét, amely javíthatja a kockázati rétegződést és a CT-vel kimutatott tüdőcsomók kezelését.
A tüdőcsomókat alacsony dózisú számítógépes tomográfia (LDCT) segítségével értékelik, jóindulatú vagy rosszindulatú okokra utaló képalkotó jellemzőkkel.A csomók bizonytalan kimenetele gyakori ellenőrző látogatásokhoz, szükségtelen beavatkozásokhoz és túlkezeléshez vezethet.A diagnosztikai értékű szérum metabolikus osztályozók felvétele javíthatja a kockázatértékelést és a tüdőcsomók későbbi kezelését.PET pozitronemissziós tomográfia.
Az amerikai NLST és az európai NELSON tanulmány adatai azt sugallják, hogy a magas kockázatú csoportok alacsony dózisú számítógépes tomográfia (LDCT) szűrése csökkentheti a tüdőrák mortalitást1,3.Mindazonáltal továbbra is az LDCT által észlelt nagyszámú véletlenszerű tüdőcsomó kockázatértékelése és ezt követő klinikai kezelése jelenti a legnagyobb kihívást.A fő cél a meglévő LDCT-alapú protokollok helyes osztályozásának optimalizálása megbízható biomarkerek beépítésével.
Bizonyos molekuláris biomarkereket, például vér metabolitokat azonosítottak a tüdőrák és az egészséges kontrollok összehasonlításával15,17.Jelen tanulmányunkban a szérum metabolomikai elemzés alkalmazására összpontosítottunk az LDCT által véletlenül észlelt jóindulatú és rosszindulatú tüdőcsomók megkülönböztetésére.Összehasonlítottuk az egészséges kontroll (HC), a jóindulatú tüdőcsomók (BN) és az I. stádiumú tüdő adenokarcinóma (LA) minták globális szérum metabolomját UPLC-HRMS analízis segítségével.Azt találtuk, hogy a HC és a BN metabolikus profilja hasonló volt, míg az LA szignifikáns változásokat mutatott a HC-hoz és a BN-hez képest.A szérum metabolitok két csoportját azonosítottuk, amelyek megkülönböztetik az LA-t a HC-től és a BN-től.
A jóindulatú és rosszindulatú csomók jelenlegi LDCT-alapú azonosítási sémája főként a csomók méretén, sűrűségén, morfológiáján és időbeli növekedési sebességén alapul30.Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a csomók mérete szorosan összefügg a tüdőrák valószínűségével.Még a magas kockázatú betegeknél is <1% a malignitás kockázata a 6 mm-nél kisebb csomópontokban.A 6-20 mm-es csomók rosszindulatú daganatának kockázata 8% és 64% között mozog30.Ezért a Fleischner Társaság 6 mm-es vágási átmérőt javasol a rutin CT-követéshez.29 A 6 mm-nél nagyobb, határozatlan tüdőcsomók (IPN) kockázatértékelését és kezelését azonban nem végezték el megfelelően31.A veleszületett szívbetegség jelenlegi kezelése általában éber várakozáson alapul, gyakori CT-ellenőrzéssel.
A validált metabolom alapján első alkalommal mutattuk ki az egészséges egyének és a 6 mm-nél kisebb jóindulatú csomók közötti metabolomikus aláírások átfedését.A biológiai hasonlóság összhangban van a korábbi CT-leletekkel, miszerint a 6 mm-nél kisebb csomóknál a rosszindulatú daganatok kockázata ugyanolyan alacsony, mint a csomópontok nélküli alanyoknál.30 Megjegyzendő, hogy eredményeink azt is bizonyítják, hogy a 6 mm-nél kisebb és ≥6 mm-es jóindulatú csomók esetében magas a kockázata. hasonlóság a metabolomikus profilokban, ami arra utal, hogy a jóindulatú etiológia funkcionális meghatározása konzisztens a csomó méretétől függetlenül.Így a modern diagnosztikai szérum metabolit panelek egyetlen tesztet biztosíthatnak kizárási tesztként, amikor a CT-vizsgálat kezdetben csomókat észlel, és potenciálisan csökkenti a sorozatos monitorozást.Ugyanakkor a metabolikus biomarkerek ugyanazon panelje megkülönböztette a 6 mm-nél nagyobb malignus csomókat a jóindulatú csomóktól, és pontos előrejelzéseket adott a hasonló méretű IPN-ekre és a CT-képeken kétértelmű morfológiai jellemzőkre.Ez a szérum metabolizmus osztályozó jól teljesített a 6 mm-nél nagyobb csomók rosszindulatú daganatának előrejelzésében, 0,927 AUC értékkel.Összességében eredményeink azt mutatják, hogy az egyedi szérum metabolomikus szignatúrák specifikusan tükrözhetik a korai daganatok által kiváltott metabolikus változásokat, és potenciális kockázati előrejelzők lehetnek, függetlenül a csomó méretétől.
Nevezetesen, a tüdő adenokarcinóma (LUAD) és a laphámsejtes karcinóma (LUSC) a nem kissejtes tüdőrák (NSCLC) fő típusai.Tekintettel arra, hogy a LUSC szorosan összefügg a dohányhasználattal47, és a LUAD a CT-szűrés során kimutatott véletlen tüdőcsomók leggyakoribb szövettana48, osztályozó modellünket kifejezetten az I. stádiumú adenokarcinóma mintákra építettük.Wang és munkatársai szintén a LUAD-ra összpontosítottak, és kilenc lipid aláírást azonosítottak lipidomika segítségével, hogy megkülönböztessék a korai stádiumú tüdőrákot az egészséges egyénektől17.A jelenlegi osztályozó modellt 16 I. stádiumú LUSC eseten és 74 jóindulatú csomón teszteltük, és alacsony LUSC előrejelzési pontosságot figyeltünk meg (AUC 0,776), ami arra utal, hogy a LUAD és a LUSC saját metabolomikus aláírással rendelkezhetnek.Valójában kimutatták, hogy a LUAD és a LUSC különböznek etiológiájukban, biológiai eredetükben és genetikai rendellenességeikben49.Ezért a szűrőprogramokban a tüdőrák populáció alapú kimutatására szolgáló képzési modellekbe más típusú szövettani vizsgálatokat is be kell vonni.
Itt azonosítottuk a tüdő adenokarcinóma hat leggyakrabban megváltozott útvonalát az egészséges kontrollokhoz és a jóindulatú csomókhoz képest.A xantin és a hipoxantin a purin anyagcsereútjának gyakori metabolitjai.Eredményeinkkel összhangban a purin metabolizmussal kapcsolatos intermedierek szignifikánsan megemelkedtek a tüdő adenokarcinómás betegek szérumában vagy szöveteiben, mint az egészséges kontrollokban vagy a preinvazív stádiumban lévő betegekben15,50.Az emelkedett szérum xantin és hipoxantin szint a gyorsan szaporodó rákos sejtek által igényelt anabolizmust tükrözheti.A glükóz metabolizmus szabályozási zavara a rák metabolizmusának jól ismert ismertetőjele51.Itt a piruvát és a laktát szignifikáns növekedését figyeltük meg az LA csoportban a HC és BN csoporthoz képest, ami összhangban van a glikolitikus útvonal rendellenességeiről szóló korábbi jelentésekkel a nem kissejtes tüdőrákos (NSCLC) betegek szérum metabolom profiljában, és egészséges kontrollok.az eredmények konzisztensek52,53.
Fontos, hogy fordított korrelációt figyeltünk meg a piruvát és a triptofán metabolizmusa között a tüdő adenokarcinómák szérumában.A szérum triptofán szintje csökkent az LA csoportban a HC vagy BN csoporthoz képest.Érdekes módon egy korábbi nagyszabású tanulmány, amelyben egy leendő kohorsz vett részt, azt találta, hogy a keringő triptofán alacsony szintje a tüdőrák fokozott kockázatával jár 54 .A triptofán egy esszenciális aminosav, amelyet teljes egészében élelmiszerekből kapunk.Arra a következtetésre jutottunk, hogy a szérum triptofán kiürülése tüdő adenokarcinómában ennek a metabolitnak a gyors kimerülését tükrözheti.Köztudott, hogy a triptofán-katabolizmus végterméke a kinurenin útvonalon keresztül a de novo NAD+ szintézis forrása.Mivel a NAD+ elsősorban a mentési úton termelődik, a NAD+ fontossága a triptofán metabolizmusában az egészségben és a betegségekben még tisztázásra vár46.A TCGA adatbázis elemzése azt mutatta, hogy a triptofán transzporter oldott transzporter 7A5 (SLC7A5) expressziója szignifikánsan megnövekedett tüdő adenokarcinómában a normál kontrollokhoz képest, és pozitív korrelációt mutatott a GAPDH glikolitikus enzim expressziójával.A korábbi tanulmányok főként a triptofán katabolizmusának a daganatellenes immunválasz elnyomásában betöltött szerepére összpontosítottak40,41,42.Itt bemutatjuk, hogy a triptofánfelvétel gátlása az SLC7A5 leütésével tüdőráksejtekben a sejtes NAD szintjének későbbi csökkenését és a glikolitikus aktivitás egyidejű gyengülését eredményezi.Összefoglalva, tanulmányunk biológiai alapot ad a tüdő adenokarcinóma rosszindulatú átalakulásával összefüggő szérum metabolizmus változásaihoz.
Az EGFR-mutációk a leggyakoribb meghajtó mutációk NSCLC-ben szenvedő betegeknél.Vizsgálatunk során azt találtuk, hogy az EGFR mutációval rendelkező betegek (n = 41) általános metabolomikus profilja hasonló volt a vad típusú EGFR-ben szenvedő betegekéhez (n = 31), bár egyes EGFR-mutáns betegek szérumszintjét csökkentettük az acilkarnitinben szenvedő betegeknél.Az acilkarnitinek bevett funkciója, hogy acilcsoportokat szállítsanak a citoplazmából a mitokondriális mátrixba, ami a zsírsavak oxidációjához vezet az energiatermelés érdekében 55 .Eredményeinkkel összhangban egy közelmúltbeli tanulmány hasonló metabolomprofilokat azonosított az EGFR mutáns és az EGFR vad típusú daganatok között 102 tüdő adenokarcinóma szövetminta globális metabolomjának elemzésével50.Érdekes módon acilkarnitin tartalmat találtak az EGFR mutáns csoportban is.Ezért további tanulmányozást érdemelhet, hogy az acilkarnitinszint változásai tükrözik-e az EGFR által kiváltott metabolikus változásokat és a mögöttes molekuláris útvonalakat.
Összefoglalva, tanulmányunk egy szérum metabolikus osztályozót hoz létre a pulmonalis csomók differenciáldiagnózisához, és olyan munkafolyamatot javasol, amely optimalizálhatja a kockázatértékelést és megkönnyítheti a CT-szűrés alapján a klinikai kezelést.
Ezt a tanulmányt a Szun Jat-szen Egyetemi Rákkórház etikai bizottsága, a Szun Jat-szen Egyetem első társkórháza és a Zhengzhou Egyetemi Rákkórház Etikai Bizottsága hagyta jóvá.A felfedezési és belső validálási csoportokban 174 szérumot egészséges egyénektől és 244 jóindulatú csomókból származó szérumot gyűjtöttek be a Szun Jat-szen Egyetem Rákközpontjának Rákellenőrzési és Megelőzési Osztályán éves orvosi vizsgálaton átesett egyénektől és 166 jóindulatú csomót.szérum.Az I. stádiumú tüdő adenokarcinómákat a Sun Yat-sen University Cancer Centerből gyűjtöttük be.A külső validálási kohorszban 48 esetben volt jóindulatú csomó, 39 esetben I. stádiumú tüdőadenokarcinóma a Szun Jat-szen Egyetem első társkórházából és 24 esetben I. stádiumú tüdőadenokarcinóma a Zhengzhou Cancer Hospitalból.A Szun Jat-szen Egyetem Rákkutató Központja 16 I. stádiumú laphámsejtes tüdőrák esetet is összegyűjtött, hogy tesztelje a kialakult metabolikus osztályozó diagnosztikai képességét (a betegek jellemzőit az 5. kiegészítő táblázat tartalmazza).A felfedezési kohorszból és a belső validációs kohorszból mintákat gyűjtöttek 2018 januárja és 2020 májusa között. A külső validációs kohorsz mintáit 2021 augusztusa és 2022 októbere között gyűjtöttük. A nemek közötti torzítás minimalizálása érdekében hozzávetőlegesen azonos számú férfi és női esetet rendeltek hozzá. kohorsz.Felfedezési csapat és belső felülvizsgálati csapat.A résztvevők nemét önbevallás alapján határozták meg.Minden résztvevőtől tájékozott beleegyezést kaptak, és nem biztosítottak kompenzációt.A jóindulatú csomókkal rendelkező alanyok azok voltak, akiknél az elemzés időpontjában 2-5 éves CT-vizsgálati pontszám stabil volt, kivéve 1 esetet a külső validációs mintából, amelyet preoperatívan gyűjtöttek és kórszövettani vizsgálattal diagnosztizáltak.A krónikus hörghurut kivételével.A tüdő adenocarcinoma eseteit a tüdő reszekciója előtt gyűjtöttük össze, és patológiás diagnózissal igazoltuk.Az éhgyomri vérmintákat szérumleválasztó csövekbe gyűjtöttük, antikoaguláns nélkül.A vérmintákat 1 órán át szobahőmérsékleten alvadtuk, majd 2851 × g-vel centrifugáltuk 10 percig 4 °C-on, hogy összegyűjtsük a szérum felülúszóját.A szérum alikvot részeket -80 °C-on lefagyasztottuk a metabolit extrakcióig.A Szun Jat-szen Egyetem Rákközpontjának Rákmegelőzési és Orvosi Vizsgálati Osztálya 100 egészséges donortól gyűjtött össze szérumkészletet, köztük egyenlő számú, 40 és 55 év közötti férfi és nő között.Minden donormintából egyenlő térfogatokat összekeverünk, a kapott készletet aliquot részekre osztjuk és -80 °C-on tároljuk.A szérumkeveréket referenciaanyagként használták a minőség-ellenőrzéshez és az adatok szabványosításához.
A referenciaszérumot és a tesztmintákat felolvasztották, és a metabolitokat kombinált extrakciós módszerrel (MTBE/metanol/víz) 56 extraháltuk.Röviden, 50 μl szérumot összekevertünk 225 μl jéghideg metanollal és 750 μl jéghideg metil-terc-butil-éterrel (MTBE).Keverjük össze a keveréket, és inkubáljuk jégen 1 órán át.A mintákat ezután összekevertük és vortex-el kevertük 188 μl MS-minőségű, belső standardokat (13C-laktát, 13C3-piruvát, 13C-metionin és 13C6-izoleucin, a Cambridge Isotope Laboratories-tól vásárolt) tartalmazó vízzel.Az elegyet ezután 15 000 × g-vel centrifugáltuk 10 percig 4 °C-on, majd az alsó fázist két csőbe (egyenként 125 µl) vittük át az LC-MS elemzéshez pozitív és negatív módban.Végül a mintát nagy sebességű vákuumkoncentrátorban szárazra pároltuk.
A szárított metabolitokat 120 μl 80%-os acetonitrilben oldottuk fel, 5 percig vortexeltük, majd 15 000 × g-vel centrifugáltuk 10 percig 4 °C-on.A felülúszókat mikrobetétekkel ellátott borostyánsárga üvegfiolákba vittük át metabolomikai vizsgálatokhoz.Céltalan metabolomikai elemzés ultra-teljesítményű folyadékkromatográfiás-nagyfelbontású tömegspektrometriás (UPLC-HRMS) platformon.A metabolitokat Dionex Ultimate 3000 UPLC rendszerrel és ACQUITY BEH Amide oszloppal (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters) választottuk el.Pozitív ion módban a mozgó fázisok 95% (A) és 50% acetonitril (B) voltak, mindegyik 10 mmol/l ammónium-acetátot és 0,1% hangyasavat tartalmazott.Negatív módban az A és B mozgófázis 95%, illetve 50% acetonitrilt tartalmazott, mindkét fázis 10 mmol/L ammónium-acetátot, pH = 9. A gradiens program a következő volt: 0-0,5 perc, 2% B;0,5–12 perc, 2–50% B;12–14 perc, 50–98% B;14–16 perc, 98% B;16–16.1.min, 98-2% B;16,1-20 perc, 2% B. Az oszlopot 40 °C-on, a mintát 10 °C-on tartottuk az automatikus mintavevőben.Az áramlási sebesség 0,3 ml/perc, az injekció térfogata 3 μl.A Q-Exactive Orbitrap tömegspektrométer (Thermo Fisher Scientific) elektrospray ionizációs (ESI) forrással teljes letapogatási módban működött, és a ddMS2 monitorozási móddal összekapcsolva nagy mennyiségű adatot gyűjtött.Az MS paramétereket a következőképpen állítottuk be: permetezési feszültség +3,8 kV/- 3,2 kV, kapilláris hőmérséklet 320°C, védőgáz 40 arb, segédgáz 10 arb, szondafűtő hőmérséklet 350°C, pásztázási tartomány 70-1050 m/h, felbontás.70 000. Az adatokat Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific) segítségével szereztük be.
Az adatok minőségének értékelése érdekében egyesített minőség-ellenőrzési (QC) mintákat állítottunk elő úgy, hogy minden mintából 10 μl-es alikvotokat eltávolítottak a felülúszóból.Az analitikai szekvencia elején hat minőség-ellenőrző minta injekciót elemeztünk az UPLC-MS rendszer stabilitásának felmérésére.A minőség-ellenőrzési mintákat ezt követően rendszeresen bevezetik a tételbe.Ebben a vizsgálatban mind a 11 szérumminta tételt LC-MS-sel elemeztük.100 egészséges donor szérum pool keverékének alikvotjait használtuk referenciaanyagként a megfelelő tételekben az extrakciós folyamat nyomon követésére és a tételenkénti hatások beállítására.A felfedezési kohorsz, a belső validációs kohorsz és a külső validációs kohorsz nem célzott metabolomikai elemzését a Szun Jat-szen Egyetem Metabolomikai Központjában végezték el.A Guangdong Műszaki Egyetem Elemző és Tesztközpontjának külső laboratóriuma 40 mintát is elemzett a külső kohorszból, hogy tesztelje az osztályozó modell teljesítményét.
Az extrakciót és a rekonstitúciót követően a szérum metabolitok abszolút mennyiségi meghatározását ultra-nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás-tandem tömegspektrometriával (Agilent 6495 tripla kvadrupól) és elektropermet ionizációs (ESI) forrással, többszörös reakciófigyelő (MRM) módban mértük.A metabolitok elválasztására ACQUITY BEH Amide oszlopot (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters) használtunk.A mozgófázis 90% (A) és 5% acetonitril (B) 10 mmol/l ammónium-acetáttal és 0,1% ammóniaoldattal készült.A gradiens program a következő volt: 0-1,5 perc, 0% B;1,5–6,5 perc, 0–15% B;6,5–8 perc, 15% B;8–8,5 perc, 15–0% B;8,5–11,5 perc, 0%B.Az oszlopot 40 °C-on, a mintát 10 °C-on tartottuk az automatikus mintavevőben.Az áramlási sebesség 0,3 ml/perc, az injekció térfogata pedig 1 μL.Az MS paramétereket a következőképpen állítottuk be: kapilláris feszültség ±3,5 kV, porlasztó nyomás 35 psi, köpenygáz áramlása 12 l/perc, köpenygáz hőmérséklete 350°C, szárítógáz hőmérséklete 250°C, szárítógáz áramlása 14 l/perc.A triptofán, piruvát, laktát, hipoxantin és xantin MRM-konverziója 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 és 151,0–107 volt.9 ill.Az adatokat Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies) segítségével gyűjtöttük.A szérumminták esetében a triptofán, a piruvát, a laktát, a hipoxantin és a xantin mennyiségét a standard keverék oldatok kalibrációs görbéivel határoztuk meg.A sejtminták triptofántartalmát a belső standardra és a sejtfehérje tömegre normalizáltuk.
A csúcskivonást (m/z és retenciós idő (RT)) Compound Discovery 3.1 és TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific) segítségével végeztük.A tételek közötti potenciális különbségek kiküszöbölése érdekében a vizsgálati minta minden egyes jellemző csúcsát elosztottuk az ugyanabból a tételből származó referenciaanyag jellemző csúcsával, hogy megkapjuk a relatív bőséget.A belső standardok standardizálás előtti és utáni relatív szórását a 6. kiegészítő táblázat tartalmazza. A két csoport közötti különbségeket hamis felfedezési arány (FDR<0,05, Wilcoxon előjeles rangteszt) és szorzós változás (>1,2 vagy <0,83) jellemeztük.A kivont jellemzők nyers MS-adatai és a szérummal korrigált referencia-MS-adatok az 1. kiegészítő adatban és a 2. kiegészítő adatban láthatók.A csúcs annotációt négy meghatározott azonosítási szint alapján végezték el, beleértve az azonosított metabolitokat, feltételezetten annotált vegyületeket, feltételezetten jellemzett vegyületosztályokat és ismeretlen vegyületeket 22 .A Compound Discovery 3.1-ben (mzCloud, HMDB, Chemspider) végzett adatbázis-keresések alapján végül olyan biológiai vegyületeket választottak ki, amelyek MS/MS megfelelt a validált szabványoknak vagy pontos egyezésű annotációkkal mzCloudban (pontszám > 85) vagy Chemspiderben, mint közbenső termékek a differenciális metabolom között.Az egyes jellemzők csúcsértékeit a 3. kiegészítő adatok tartalmazzák. A MetaboAnalyst 5.0-t használtuk az összegnormalizált metabolit-bőség egyváltozós elemzésére.A MetaboAnalyst 5.0 a KEGG-útvonal-dúsítási analízist is értékelte jelentősen eltérő metabolitok alapján.A főkomponens-analízist (PCA) és a részleges legkisebb négyzetek diszkriminanciaanalízist (PLS-DA) a ropls szoftvercsomag (v.1.26.4) segítségével elemeztük veremnormalizálással és automatikus skálázással.Az optimális metabolit biomarker modellt a csomó rosszindulatúságának előrejelzésére bináris logisztikus regresszióval, legkisebb abszolút zsugorodás és szelekciós operátor segítségével állítottuk elő (LASSO, R csomag v.4.1-3).A diszkrimináns modell teljesítményét a detektálási és validációs készletekben a ROC analízis alapján becsült AUC jellemezte a pROC csomag szerint (v.1.18.0.).Az optimális valószínűségi határértéket a modell maximális Youden indexe alapján kaptuk meg (érzékenység + specificitás – 1).A küszöbértéknél kisebb vagy nagyobb értékű minták jóindulatú csomókként, illetve tüdő adenokarcinómának számítanak.
Az A549 sejteket (#CCL-185, American Type Culture Collection) 10% FBS-t tartalmazó F-12K tápközegben növesztettük.Az SLC7A5-öt megcélzó rövid hajtű RNS (shRNS) szekvenciákat és egy nem célzó kontrollt (NC) inszertáltunk a pLKO.1-puro lentivírus vektorba.Az shSLC7A5 antiszensz szekvenciái a következők: Sh1 (5'-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3'), Sh2 (5'-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3').Az SLC7A5 (#5347) és a tubulin (#2148) elleni antitesteket a Cell Signaling Technology cégtől vásároltuk.Az SLC7A5 és tubulin elleni antitesteket 1:1000 hígításban használtuk a Western blot analízishez.
A Seahorse XF glikolitikus stressz teszt az extracelluláris savasodás (ECAR) szintjét méri.A vizsgálat során glükózt, oligomicint A-t és 2-DG-t adagoltunk egymás után, hogy teszteljük a sejt glikolitikus kapacitását, az ECAR-val mérve.
A nem célzó kontrollal (NC) és shSLC7A5-tel (Sh1, Sh2) transzfektált A549 sejteket egy éjszakán át 10 cm átmérőjű edényekbe szélesztettük.A sejtmetabolitokat 1 ml jéghideg 80%-os vizes metanollal extraháltuk.A metanolos oldatban lévő sejteket lekapartuk, egy új csőbe gyűjtöttük, és 15 000 x g-vel centrifugáltuk 15 percig 4 °C-on.Gyűjts össze 800 µl felülúszót, és szárítsd meg nagy sebességű vákuumkoncentrátorral.A szárított metabolit pelleteket ezután triptofánszintre elemeztük LC-MS/MS alkalmazásával, a fent leírtak szerint.A sejtes NAD(H) szinteket az A549 sejtekben (NC és shSLC7A5) kvantitatív NAD+/NADH kolorimetriás kittel (#K337, BioVision) mértük a gyártó utasításai szerint.A metabolitok mennyiségének normalizálása érdekében minden mintánál megmértük a fehérjeszinteket.
A minta méretének előzetes meghatározásához statisztikai módszereket nem alkalmaztunk.A biomarkerek felfedezését célzó korábbi metabolomikai tanulmányokat15,18 a méretmeghatározás referenciaértékének tekintették, és ezekkel a jelentésekkel összehasonlítva a mintánk megfelelő volt.Egyetlen mintát sem zártak ki a vizsgálati kohorszból.A szérummintákat véletlenszerűen besorolták egy felfedezési csoportba (306 eset, 74,6%) és egy belső validációs csoportba (104 eset, 25,4%) a nem célzott metabolomikai vizsgálatokhoz.Minden csoportból véletlenszerűen kiválasztottunk 70 esetet a célzott metabolomikai vizsgálatok felfedezési halmazából.Az LC-MS adatgyűjtés és -elemzés során a kutatók vakok voltak a csoportbeosztásra.A metabolomikai adatok statisztikai elemzését és a sejtkísérleteket a megfelelő Eredmények, Ábra-legendák és Módszerek szakaszok ismertetik.A celluláris triptofán, NADT és glikolitikus aktivitás mennyiségi meghatározását háromszor végeztük el egymástól függetlenül, azonos eredményekkel.
A tanulmánytervvel kapcsolatos további információkért tekintse meg a cikkhez kapcsolódó Natural Portfolio Report Abstract-ot.
A kivont jellemzők nyers MS-adatai és a referenciaszérum normalizált MS-adatai az 1. kiegészítő adatban és a 2. kiegészítő adatban láthatók.A különbségi jellemzőkre vonatkozó csúcsjegyzeteket a 3. kiegészítő adat tartalmazza. A LUAD TCGA adatkészlet letölthető a https://portal.gdc.cancer.gov/ címről.A grafikon ábrázolásához szükséges bemeneti adatokat a forrásadatok tartalmazzák.A cikk forrásadatait közöljük.
Országos Tüdőszűrési Tanulmányi Csoport stb. Tüdőrák halálozásának csökkentése alacsony dózisú komputertomográfiával.Észak-Anglia.J. Med.365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR és Prophet, PC Tüdőrák-szűrés alacsony dózisú helikális CT-vel: a National Lung Screening Study (NLST) eredményei.J. Med.Screen 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ és mtsai.A tüdőrák mortalitás csökkentése volumetrikus CT-szűréssel egy randomizált vizsgálatban.Észak-Anglia.J. Med.382, 503–513 (2020).
Feladás időpontja: 2023.09.18